本文關(guān)鍵詞：人間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性及免疫抑制作用機(jī)制的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《吉林大學(xué)》 2015年

人間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性及免疫抑制作用機(jī)制的研究

李秀英  

【摘要】：間充質(zhì)干細(xì)胞（Mesenchymal Stem Cell; MSC）是一類存在于多種組織中并具有自我復(fù)制及多向分化潛能的細(xì)胞。最初由Friedenstein等在骨髓中發(fā)現(xiàn)，隨后在其他組織中陸續(xù)發(fā)現(xiàn)MSC的存在，如脂肪組織、臍帶華頓氏膠、胎盤組織等。MSC不僅具有較強(qiáng)的增殖能力和多向分化能力，還具有免疫抑制作用，可以抑制同種異體組織移植所引起的免疫排斥反應(yīng)，延長移植物生存時(shí)間。這些特性使MSC在治療免疫系統(tǒng)疾病及組織、器官移植中有重要的應(yīng)用價(jià)值。由于目前關(guān)于MSC免疫抑制作用的機(jī)制尚不是十分清晰，尤其對T淋巴細(xì)胞增殖抑制作用機(jī)制存在較大爭議，因此不能保證MSC的臨床應(yīng)用效果及臨床治療的安全性。鑒于此，本研究選取了MSC中來源廣泛且容易獲得的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BM-MSC）、脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（AT-MSC）、臍帶華頓氏膠間充質(zhì)干細(xì)胞（WJ-MSC）和胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞（PL-MSC），比較其生物學(xué)特性并挑選出對于修復(fù)組織損傷更有優(yōu)勢的MSC；在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究該MSC免疫抑制作用的分子機(jī)制。以上研究可為MSC更安全有效的進(jìn)行醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的應(yīng)用提供基礎(chǔ)理論及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 1．人BM-MSC、AT-MSC、WJ-MSC和PL-MSC的分離、培養(yǎng)及鑒定 目的：采用一種簡單有效地分離培養(yǎng)BM-MSC、AT-MSC、WJ-MSC和PL-MSC的方法，并觀察其形態(tài)，檢測細(xì)胞表面抗原的表達(dá)及其成脂、成骨的能力，為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)提供充足的干細(xì)胞材料。方法：采用酶消化法分離提純AT-MSC、WJ-MSC和PL-MSC，采用全骨髓組織貼壁法分離提純BM-MSC；通過倒置顯微鏡對細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行觀察；運(yùn)用流式細(xì)胞儀檢測兩種分離方法得到的四種細(xì)胞表面抗原的表達(dá)；對四種MSC的多向分化潛能進(jìn)行檢測，包括成脂和成骨能力。結(jié)果：消化法可以成功分離出AT-MSC、WJ-MSC和PL-MSC，全骨髓組織貼壁法也可以分離獲得BM-MSC，四種MSC均呈纖維細(xì)胞樣貼壁生長；對細(xì)胞表面抗原進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)四種細(xì)胞的表達(dá)情況類似，均能陽性表達(dá)CD44、CD73、CD90和CD105等MSC的表面抗原，而不表達(dá)CD14、CD34和CD45等血液和內(nèi)皮系統(tǒng)的表面抗原；通過對四種MSC多向分化能力的檢測，發(fā)現(xiàn)四種細(xì)胞均具有成脂和成骨的能力；以上結(jié)果均符合國際細(xì)胞治療學(xué)會對MSC的定義和標(biāo)準(zhǔn)，說明從上述組織中分離出的細(xì)胞均符合MSC的特性。結(jié)論：成功分離出BM-MSC、AT-MSC、WJ-MSC和PL-MSC，且細(xì)胞符合MSC的標(biāo)準(zhǔn)，包括細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞表面抗原的表達(dá)情況和多向分化的能力，適用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。 2．四種MSC的分化及增殖能力對比 目的：比較四種MSC的增殖能力、成脂及成骨的分化能力。方法：采用活細(xì)胞計(jì)數(shù)方法檢測四種MSC增殖能力；運(yùn)用流式細(xì)胞技術(shù)檢測四種細(xì)胞的細(xì)胞周期；采用成脂和成骨誘導(dǎo)分化試劑盒誘導(dǎo)分化MSC；采用成脂細(xì)胞計(jì)數(shù)方法檢測四種MSC成脂分化能力，利用骨結(jié)節(jié)分析的方法檢測四種MSC成骨分化能力。結(jié)果：WJ-MSC的增殖能力最強(qiáng)（P0.001），其次為：AT-MSC、PL-MSC和BM-MSC；AT-MSC的成脂能力最強(qiáng)（P0.001），其次為：WJ-MSC、BM-MSC和PL-MSC；WJ-MSC的成骨能力最強(qiáng)（P0.001），其次為：PL-MSC、AT-MSC和BM-MSC。結(jié)論：WJ-MSC具有較強(qiáng)的增殖能力和成骨分化能力，AT-MSC具有較強(qiáng)的成脂能力。 3．MSC對T淋巴細(xì)胞的抑制作用及其分子機(jī)制研究 3.1四種MSC對T淋巴細(xì)胞的抑制作用 目的：比較四種MSC對T淋巴細(xì)胞增殖的抑制作用。方法：采用共培養(yǎng)（MSC與T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)比例為1:1、1:5、1:10、1:20、1:50）和Brdu方法檢測不同數(shù)量MSC對植物血凝素（PHA）激活的T淋巴細(xì)胞增殖能力的抑制作用。結(jié)果：四種MSC均明顯抑制T淋巴細(xì)胞增殖，且呈細(xì)胞數(shù)量依賴性，WJ-MSC、AT-MSC和PL-MSC抑制能力均強(qiáng)于BM-MSC（P0.05），且WJ-MSC的抑制作用最強(qiáng)。結(jié)論：四種MSC對T淋巴細(xì)胞的增殖能力有抑制作用，且WJ-MSC對T淋巴細(xì)胞增殖能力的抑制作用較強(qiáng)。 3.2共培養(yǎng)體系中WJ-MSC的吲哚胺2,3-雙加氧酶（IDO）表達(dá)及活性 目的：檢測與T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)后WJ-MSC的IDO表達(dá)水平及其活性，觀察IDO與T淋巴細(xì)胞增殖能力之間的關(guān)系。方法：通過RT-PCR及Western blot方法檢測與T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)后WJ-MSC的IDO基因表達(dá)；高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀（HPLC-MS/MS）檢測共培養(yǎng)體系中IDO的活性及1-甲基色氨酸（1-MT）對IDO的中和作用；用ELISA試劑盒檢測共培養(yǎng)上清液中IFN-γ的含量。結(jié)果：ELISA結(jié)果顯示單獨(dú)培養(yǎng)的WJ-MSC不分泌IFN-γ，而激活后的T淋巴細(xì)胞分泌大量的IFN-γ并刺激共培養(yǎng)中的WJ-MSC表達(dá)IDO；WJ-MSC反過來抑制T淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ；RT-PCR、Western blot及HPLC-MS/MS結(jié)果顯示共培養(yǎng)后的WJ-MSC表達(dá)有活性的IDO，且其活性明顯高于對照組（P0.001）；共培養(yǎng)體系中加入IDO的活性抑制劑1-MT后，T淋巴細(xì)胞的增殖能力恢復(fù)81%以上。結(jié)論：被激活的T淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ，且通過IFN-γ誘導(dǎo)WJ-MSC表達(dá)有活性的IDO；有活性的IDO抑制T淋巴細(xì)胞增殖，推斷IDO是MSC發(fā)揮免疫抑制作用的機(jī)制之一。 3.3WJ-MSC阻滯T淋巴細(xì)胞周期進(jìn)程 目的：探討WJ-MSC對T淋巴細(xì)胞抑制作用的分子機(jī)制。方法：共培養(yǎng)體系中分別加入或不加入IDO抑制劑1-MT，采用細(xì)胞周期檢測試劑盒檢測T淋巴細(xì)胞的細(xì)胞周期；qRT-PCR檢測相關(guān)基因mRNA水平。結(jié)果：WJ-MSC阻滯T淋巴細(xì)胞的G1→S期進(jìn)程，處于G0/G1期細(xì)胞數(shù)量增多，其SPF值、PI值小于對照組（P0.001）；與對照組相比，，共培養(yǎng)組T淋巴細(xì)胞的增殖相關(guān)基因CDK4的mRNA水平下調(diào)（P0.001）；加入1-MT后T淋巴細(xì)胞的S期細(xì)胞數(shù)幾乎恢復(fù)到對照組水平，同時(shí)增殖相關(guān)基因CDK4的mRNA幾乎恢復(fù)到對照組水平。結(jié)論：WJ-MSC對T淋巴細(xì)胞增殖的抑制是通過表達(dá)有活性的IDO下調(diào)T淋巴細(xì)胞CDK4的基因水平并阻滯其細(xì)胞周期G1→S期進(jìn)程來實(shí)現(xiàn)的。 3.4WJ-MSC促進(jìn)T淋巴細(xì)胞凋亡 目的：分析WJ-MSC對T淋巴細(xì)胞凋亡的影響及相關(guān)基因的表達(dá)情況。方法：共培養(yǎng)體系中分別加入或不加入IDO抑制劑1-MT，采用Annexin V-FITC/PI檢測細(xì)胞凋亡；qRT-PCR檢測相關(guān)基因mRNA水平。結(jié)果：與對照組相比，WJ-MSC能夠促進(jìn)T淋巴細(xì)胞凋亡（P0.001），凋亡率為（22.8±1.6）%；與對照組相比，共培養(yǎng)組T淋巴細(xì)胞的抑制凋亡基因Bcl2下調(diào)而促凋亡相關(guān)基因Caspase3上調(diào)（P0.001）；加入1-MT后T淋巴細(xì)胞的凋亡率幾乎恢復(fù)到對照組水平，同時(shí)凋亡相關(guān)基因的mRNA幾乎恢復(fù)到對照組水平。結(jié)論：WJ-MSC通過表達(dá)有活性的IDO促進(jìn)T淋巴細(xì)胞凋亡，并且是通過Bcl2/caspase途徑誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞凋亡。 4．與WJ-MSC共培養(yǎng)的T淋巴細(xì)胞內(nèi)參基因的篩選 目的：評價(jià)與WJ-MSC共培養(yǎng)的T淋巴細(xì)胞內(nèi)參基因的穩(wěn)定性。方法：選擇18S、GAPDH、ACTB、PPIA、B2M、RPL13A、HPRT1和TBP8種內(nèi)參基因，采用geNorm、NormFinder和BestKeeper這3個(gè)軟件全面評價(jià)與MSC共培養(yǎng)后的T淋巴細(xì)胞的內(nèi)參穩(wěn)定性。結(jié)果：B2M是理想的穩(wěn)定內(nèi)參基因，而常用的內(nèi)參基因如ACTB和GAPDH，在T淋巴細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中并不是理想的穩(wěn)定內(nèi)參基因。結(jié)論：在與WJ-MSC共培養(yǎng)的T淋巴細(xì)胞相關(guān)實(shí)驗(yàn)中，B2M是較理想的穩(wěn)定內(nèi)參基因。

【關(guān)鍵詞】：
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R329.2
【目錄】：

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【參考文獻(xiàn)】

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10 劉述先,吳公責(zé),潘彩娥;血吸蟲感染宿主免疫抑制現(xiàn)象的研究 Ⅱ.日本血吸蟲感染鼠血清的免疫抑制作用[J];上海免疫學(xué)雜志;1984年06期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 趙曉甦;劉開彥;劉代紅;許蘭平;陳歡;黃曉軍;;血漿中吲哚2,3雙加氧酶在異基因造血干細(xì)胞移植后急性移植物抗宿主病中的免疫抑制作用[A];第12屆全國實(shí)驗(yàn)血液學(xué)會議論文摘要[C];2009年

2 周華麗;謝強(qiáng)敏;沈文會;夏靖燕;林曉霞;;格瑞三號油抗炎免疫抑制作用的機(jī)理探討[A];第七屆中國抗炎免疫藥理學(xué)術(shù)會議論文摘要集[C];2000年

3 皮先明;李恒;龍劍文;金晶;;中藥的免疫抑制作用在皮膚科的應(yīng)用[A];中華中醫(yī)藥學(xué)會皮膚科分會第七次學(xué)術(shù)年會、2010年重慶四川中西醫(yī)結(jié)合皮膚性病學(xué)術(shù)年會、全國中西醫(yī)結(jié)合診療皮膚性病新進(jìn)展新技術(shù)學(xué)習(xí)班論文匯編[C];2010年

4 皮先明;;中藥的免疫抑制作用在皮膚科的應(yīng)用[A];中華醫(yī)學(xué)會第16次全國皮膚性病學(xué)術(shù)年會摘要集[C];2010年

5 潘華新;王培訓(xùn);周聯(lián);曹柳英;梁瑞燕;;兩種雷公藤多苷片抗炎、免疫抑制作用的對比研究[A];第三屆全國中醫(yī)藥免疫學(xué)術(shù)研討會論文匯編[C];2006年

6 趙世萍;陳玉武;郭景珍;付桂香;龔海洋;李克明;;山茱萸總甙的抗炎免疫抑制作用研究[A];中國自然資源學(xué)會全國第二屆天然藥物資源學(xué)術(shù)研討會論文集[C];1997年

7 李怡棠;白金葉;劉柏合;關(guān)慕貞;程桂芳;;GZR-98免疫抑制作用研究[A];第八屆全國生化藥理學(xué)術(shù)討論會暨第七屆Servier獎頒獎大會會議摘要集[C];2003年

8 王永福;常志芳;王慧;趙義;李茹;栗占國;;硫酸長春地辛免疫抑制作用的實(shí)驗(yàn)研究[A];全國臨床免疫檢驗(yàn)研討會暨第六屆全國臨床免疫學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2009年

9 崔激;王潤田;王智華;王平;;黃芪下調(diào)Colon26腫瘤細(xì)胞免疫抑制作用的體外研究[A];中國免疫學(xué)會第五屆全國代表大會暨學(xué)術(shù)會議論文摘要[C];2006年

10 崔澂;王潤田;王智華;王平;;黃芪下調(diào)Colon26腫瘤細(xì)胞免疫抑制作用的體外研究[A];河北省免疫學(xué)會第5次會員代表暨學(xué)術(shù)大會論文摘要集[C];2006年

中國重要報(bào)紙全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 陳崢;[N];中國醫(yī)藥報(bào);2004年

2 梁薇;[N];中國醫(yī)藥報(bào);2005年

3 記者 劉海英;[N];科技日報(bào);2013年

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前7條

1 許文平;去甲澤拉木醛的免疫抑制作用及藥代動力學(xué)研究[D];復(fù)旦大學(xué);2012年

2 李秀英;人間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性及免疫抑制作用機(jī)制的研究[D];吉林大學(xué);2015年

3 馮璞;雷公藤多甙與TGP的協(xié)同免疫抑制作用及其對實(shí)驗(yàn)性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎的防治作用研究[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué);1998年

4 劉欣燕;青蒿琥酯、氧化苦參堿對L929腫瘤細(xì)胞免疫抑制作用影響及相關(guān)分子機(jī)制研究[D];河北醫(yī)科大學(xué);2008年

5 林新;1. A鏈鏈內(nèi)二硫鍵錯(cuò)接（A11Ser，A12Cys）胰島素突變體的構(gòu)建、表達(dá)及其活性分析 2. 淫羊藿化合物抗腫瘤活性篩選和小檗胺免疫抑制作用的研究[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué);1998年

6 倫玉寧;四氫嘧啶類化合物ZL-5015的免疫抑制作用及其作用機(jī)制研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2013年

7 王娜;肝再生增強(qiáng)因子免疫抑制作用與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的關(guān)系及相關(guān)機(jī)制研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2013年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前6條

1 韓艷鑫;骨髓增生異常綜合征患者骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的免疫抑制作用[D];山東大學(xué);2012年

2 魏曉平;天然藥物XGD-1免疫抑制作用的實(shí)驗(yàn)研究[D];昆明醫(yī)學(xué)院;2003年

3 亓俊華;TNF-α增強(qiáng)小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞免疫抑制作用的探討[D];青島大學(xué);2014年

4 莫正魁;青蒿素對小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)的免疫抑制作用[D];昆明醫(yī)學(xué)院;2004年

5 曹寧;南山藤活性成份的免疫抑制作用研究[D];南京大學(xué);2012年

6 周炳娟;維生素C預(yù)處理對脫氧雪腐鐮刀菌烯醇誘導(dǎo)的免疫抑制作用影響的實(shí)驗(yàn)研究[D];河北醫(yī)科大學(xué);2006年

  本文關(guān)鍵詞：人間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性及免疫抑制作用機(jī)制的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：217509