【摘要】：生物進(jìn)化過程中,為了適應(yīng)不同的功能需要,演變出多種具有不同結(jié)構(gòu)特征和可以識別并結(jié)合ssDNA的蛋白模式,以更好地完成其被賦予的重要使命。目前人們已發(fā)現(xiàn)的多個可以結(jié)合ssDNA的蛋白質(zhì)的經(jīng)典結(jié)構(gòu)域包括OB folds, KH domains, RNA recognition motifs (RRMs), RecA-like domain, whirly domain以及最近剛報道的DrpA domain等等。生命體遺傳物質(zhì)的高保真復(fù)制需要染色體的精確配合與調(diào)控,該過程中必不可少的是復(fù)制體的正確組裝,引發(fā)體作為復(fù)制體在復(fù)制起始位點(diǎn)組裝的一個亞復(fù)合物,其準(zhǔn)確組裝也受到多種機(jī)制調(diào)控。引發(fā)體由若干蛋白組成,分別是解旋酶,引發(fā)酶以及多個相關(guān)的輔助銜接蛋白,它們在DNA復(fù)制過程中通過以ssDNA為模板合成復(fù)制時它們所必需的RNA引物。準(zhǔn)確及時地起始引發(fā)體的正確組裝為正常染色體的復(fù)制以及停滯的復(fù)制叉重啟奠定了基礎(chǔ)。 DnaT是大腸桿菌引發(fā)體蛋白之一,在重啟停滯的復(fù)制叉過程中發(fā)揮著重要作用。作為一個銜接蛋白,DnaT聯(lián)系著PriA-PriB-ssDNA三元復(fù)合物與DnaB/C復(fù)合物,介導(dǎo)了完整的PriA依賴的引發(fā)體的組裝,同時對于完善DNA受到損傷后復(fù)制叉重啟機(jī)制也有著重大的意義。但針對DnaT如何在此過程發(fā)揮對應(yīng)的功能,DnaT蛋白與ssDNA以何種方式結(jié)合以及DnaT蛋白與PriB之間相互作用的結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究尚屬于空白。在本研究中,通過X射線晶體學(xué)手段,我們解析了蛋白DnaT與單鏈脫氧核糖核酸片段ssDNA復(fù)合物的兩種結(jié)合狀態(tài)的三個晶體結(jié)構(gòu),分辨率分別為1.96A和2.83A以及硒代蛋白晶體2.08A。復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)展示DnaT蛋白以一種螺旋纖維狀結(jié)構(gòu)盤繞在ssDNA上,DnaT蛋白以一種base-inward的模式結(jié)合ssDNA,每個三螺旋束結(jié)構(gòu)域結(jié)合兩個堿基脫氧核苷酸。通過與同源DnaT蛋白的序列比對發(fā)現(xiàn),DnaT84-153主要通過保守的a2helix識別ssDNA的堿基部分,并通過L3loop以及α3helix穩(wěn)定蛋白與磷酸骨架的相互作用。同時,DnaT蛋白采用多個結(jié)構(gòu)域協(xié)同作用的模式來結(jié)合底物ssDNA,以更好完成相應(yīng)的生物學(xué)功能。這種蛋白折疊模式以及以三螺旋束花樣結(jié)構(gòu)域結(jié)合ssDNA的方式此前均未被報道。因此,該DnaT84-153-dT15ssDNA復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)模型揭示了一種新穎的以三螺旋束花樣結(jié)構(gòu)域結(jié)合ssDNA的模式。 鑒于復(fù)合物結(jié)構(gòu)中只能觀測到降解后的DnaT84-153片段,通過分析不同長度片段的DnaT84-179, DnaT84-153和全長DnaT蛋白對ssDNA結(jié)合能力,發(fā)現(xiàn)DnaT蛋白的N端和C端對于提高DnaT結(jié)合ssDNA的協(xié)同性發(fā)揮著重要作用。多個結(jié)合實(shí)驗(yàn)表明DnaT可以結(jié)合多種不同序列的ssDNA,沒有序列識別特異性。 底物結(jié)合實(shí)驗(yàn)和電鏡負(fù)染結(jié)果顯示DnaT可以結(jié)合到其生理底物phiX-174ssDNA上形成一種棒狀的核蛋白纖維結(jié)構(gòu),我們推測DnaT在PriA-依賴的引發(fā)體組裝和重新啟動停滯的復(fù)制叉過程起到支架的作用,為后續(xù)生物學(xué)過程提供平臺。綜合多個實(shí)驗(yàn)結(jié)果結(jié)合和已有的相關(guān)文章報道,我們提出一個關(guān)于DnaT蛋白在PriA-依賴的引發(fā)體組裝和復(fù)制叉重啟過程中如何發(fā)揮功能的模型。
[Abstract]:In the process of biological evolution, in order to meet the needs of different functions, a variety of protein patterns with different structural features and can be identified and combined with ssDNA have been developed to better accomplish the important mission they have been given. The classic domains of protein that can be combined with ssDNA, including OB folds, KH domains, RNA reco, have been found. Gnition motifs (RRMs), RecA-like domain, whirly domain, and recently reported DrpA domain, and so on. The high fidelity replication of the genetic material in the life body requires precise coordination and regulation of chromosomes, which is essential for the correct assembly of the replicas, and the initiator is a subcomposition of the replicator at the starting site of the replicator. The exact assembly is also regulated by a variety of mechanisms. The initiator consists of a number of proteins, such as a helicase, an initiating enzyme, and a number of associated auxiliary cohesions, which are required by the RNA primers for the replication of ssDNA as a template for the replication of the DNA. The replication of body and the restart of stagnant replication fork lay the foundation.
DnaT, one of the body proteins triggered by E. coli, plays an important role in reopening the stagnant replication fork. As a cohesive protein, DnaT is associated with the PriA-PriB-ssDNA three element complex and DnaB/C complex, which mediates a complete PriA dependent initiator assembly, and also has a mechanism for replicating the replication fork after the DNA is damaged. But in this study, we have analyzed the protein DnaT and single strand deoxyribonucleic acid fragment ssDN in this study. In this study, the structural biological study of the combination of DnaT protein with ssDNA and the interaction between DnaT protein and PriB is still blank. In this study, we analyzed the protein DnaT and single strand deoxyribonucleic acid fragment ssDN by means of X ray crystallography. Three crystal structures of the two binding states of the A complex, the resolution is 1.96A and 2.83A, and the crystal structure of the seleno protein crystal 2.08A. complex. The DnaT protein is coiled on ssDNA with a spiral fiber structure. The DnaT protein is combined with ssDNA in a base-inward mode, and each of the three helix bundle domains is combined with two bases. Oxygen nucleotides. By comparing with the sequence of homologous DnaT proteins, it is found that DnaT84-153 mainly identifies the base parts of ssDNA through conservative a2helix, and through the interaction of L3loop and the alpha 3helix stable protein with the phosphoric acid skeleton. At the same time, the DnaT protein uses a multi domain synergistic model to combine the substrate ssDNA to better complete the corresponding. The biological function of this protein folding pattern and the combination of the three spiral beam pattern domain with ssDNA has not been reported before. Therefore, the crystal structure model of the DnaT84-153-dT15ssDNA complex reveals a novel pattern of combining the three spiral beam pattern domain with ssDNA.
In view of the only observed DnaT84-153 fragments in the composite structure, the N end and C end of the DnaT protein were found to play an important role in improving the synergism of DnaT bound ssDNA by analyzing the binding ability of DnaT84-179, DnaT84-153 and full length DnaT protein on the ssDNA binding ability of different length fragments. SsDNA with different sequences has no sequence recognition specificity.
The results of substrate binding assay and electron microscopy negative staining showed that DnaT could form a rod like nucleoprotein fiber structure on its physiological substrate phiX-174ssDNA. We speculate that DnaT plays the role of scaffolding in the process of PriA- dependent initiator assembly and restarting the stagnant replication fork, providing a platform for subsequent biological processes. With the combination of the results and the relevant articles, we present a model for how the DnaT protein plays its functions during the initiation of PriA- dependent initiator assembly and replication forks.
【學(xué)位授予單位】：中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：Q51

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：2125570