本文選題：阿維鏈霉菌 + 阿維菌素　； 參考：《中國農(nóng)業(yè)大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：阿維鏈霉菌(Streptomyces avermitilis)產(chǎn)生的阿維菌素(avermectins)是一類十六元大環(huán)內(nèi)酯類殺蟲抗生素,廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)和畜牧業(yè)生產(chǎn)中,但阿維菌素生物合成的調(diào)控機制還有待于闡明。本工作研究了阿維鏈霉菌中一個新的AraC家族轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子SAV742和選擇性σ因子σ8(SAV741)的功能和調(diào)控機制。sav_742基因編碼AraC家族轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。對該基因進行缺失、回補和過表達,通過表型觀察和搖瓶發(fā)酵實驗,初步證實SAV742負調(diào)控阿維菌素生物合成和阿維鏈霉菌生長、正調(diào)控形態(tài)分化過程。通過EMSA和qRT-PCR實驗進一步證實,SAV742通過直接負調(diào)控阿維菌素生物合成結(jié)構(gòu)基因aveF、aveA1、aveD和aveA4的表達,抑制阿維菌素合成。SAV742還可以直接調(diào)控自身基因和上游的sig8基因的轉(zhuǎn)錄。通過DNase I footprinting和定點突變實驗確定了SAV742在自身啟動子區(qū)的結(jié)合序列,并在受SAV742調(diào)控的ave結(jié)構(gòu)基因及sig8的啟動子區(qū)發(fā)現(xiàn)了類似的序列,通過序列比對得到了SAV742的保守結(jié)合序列RCCGM-N0-15-YHGSC(R:A或G,M:A或C,Y:C或T,H:A、C或T,S:C或G,N:任一核苷酸)。根據(jù)此保守序列在全基因組范圍內(nèi)預(yù)測了SAV742的靶基因,并通過實驗驗證了其中的26個新靶基因,它們分別參與了初級代謝、次級代謝和形態(tài)分化過程。因此,SAV742是阿維鏈霉菌中一個新的全局性轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,不僅調(diào)控阿維菌素合成,而且在協(xié)調(diào)調(diào)控阿維鏈霉菌多種生理過程中扮演了重要角色。σ8是阿維鏈霉菌中首個被研究的選擇性σ因子,與天藍色鏈霉菌σ8高度同源。通過構(gòu)建sig8的缺失、回補和過表達菌株,利用搖瓶發(fā)酵和表型觀察實驗,初步證實σ8負調(diào)控阿維菌素生物合成,但不影響阿維鏈霉菌在正常情況下的生長和形態(tài)分化。通過EMSA、體外轉(zhuǎn)錄和qRT-PCR實驗進一步證實,σ8通過間接抑制阿維菌素生物合成途徑特異性調(diào)控基因aveR、直接激活下游基因sav_742的轉(zhuǎn)錄,調(diào)控阿維菌素的合成。與野生型菌株相比,sig8缺失株對NaCl、KC1、H2O2、二酰胺(diamide)和熱激更為敏感。sig8的轉(zhuǎn)錄以依賴于σ8的方式受這些環(huán)境脅迫誘導(dǎo)。通過EMSA、體外轉(zhuǎn)錄和qRT-PCR實驗確定了一系列參與熱脅迫、氧化脅迫和滲透脅迫的σ8靶基因,表明σ8通過在脅迫條件下激活相關(guān)靶基因的表達,在保護阿維鏈霉菌響應(yīng)脅迫反應(yīng)中發(fā)揮了重要作用。通過5'-RACE確定了6個σ8靶基因的啟動子區(qū)結(jié)構(gòu),并由此得到了σ8的保守結(jié)合序列BGVNVH-N15-GSNNHH(B:C,T 或 G;V:A,C 或 G;S:C或 G;H:A,C 或 T;N:任一核苷酸)。根據(jù)此保守序列預(yù)測了分屬于17個功能類群的940個σ8靶基因,暗示σ8能夠調(diào)控阿維鏈霉菌內(nèi)的多種生理活動。在本研究工作中,發(fā)現(xiàn)了通過直接負調(diào)控阿維菌素生物合成結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄,抑制阿維菌素合成的AraC家族轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子SAV742和在轉(zhuǎn)錄水平上間接負調(diào)控阿維菌素合成的選擇性σ因子σ8,為揭示阿維菌素生物合成的復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、通過基因工程手段構(gòu)建阿維菌素高產(chǎn)菌株奠定基礎(chǔ),具有重要的理論和實際意義。
[Abstract]:In this work , we have studied the expression of SAV742 and the selective sigma - factor 蟽8 ( SAV741 ) in the production of medicine , agriculture and animal husbandry . The gene coding AraC family transcription regulatory factor SAV742 and the selective sigma factor 蟽8 ( SAV741 ) have been studied . The expression of sigma - 8 gene was studied by means of EMSA , in vitro transcription and qRT - PCR . According to this conserved sequence , 940 蟽8 target genes , which belong to 17 functional groups , are predicted . It is suggested that 蟽8 can regulate various physiological activities in Streptomyces avermitilis . In the work of this study , it has been found that by directly negatively controlling the transcription of the biosynthesis structure of abamectin , the transcription regulation factor SAV742 of the AraC family which can inhibit the synthesis of abamectin and the selective sigma factor 蟽 8 which indirectly control the synthesis of abamectin at the transcriptional level are found , which lays the foundation for the construction of high - yield strains of abamectin by means of genetic engineering .
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：Q78

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 羅帥;孫地;陳芝;文瑩;;ECF-σ~5因子參與阿維鏈霉菌中阿維菌素合成和環(huán)境脅迫的研究[J];微生物學(xué)報;2016年03期

2 ;An adpA homologue in Streptomyces avermitilis is involved in regulation of morphogenesis and melanogenesis[J];Chinese Science Bulletin;2007年05期

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前2條

1 范與慶;nsdA基因中斷及orfX基因整合表達對阿維鏈霉菌次級代謝的影響[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2007年

2 王曉芳;阿維鏈霉菌調(diào)節(jié)基因aveR1, aveR2缺失對阿維菌素產(chǎn)量的影響及缺失突變株發(fā)酵條件的優(yōu)化[D];中國農(nóng)業(yè)大學(xué);2005年

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本文編號：2106419