本文選題：釀酒酵母 + 分泌途徑�。� 參考：《山東大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是食品級安全性的模式真菌,具有良好的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)性能,是極具潛力的細胞工廠底盤細胞。雖然其具備完善的蛋白分泌途徑及翻譯后修飾系統(tǒng),但異源蛋白分泌表達的活性普遍較低。而蛋白質(zhì)的高效分泌表達,應(yīng)用于生物技術(shù)方面的意義不言而喻。通過分泌途徑,在釀酒酵母中高活性表達纖維素酶,是實現(xiàn)纖維素乙醇的統(tǒng)合生物加工過程(Consolidated bioprocess, CBP)的有效方式。CBP是將纖維素降解酶類的生產(chǎn)、纖維素底物的水解和糖份的乙醇發(fā)酵等幾個過程的整合,通過一種微生物完成的生物加工過程。同時,厭氧細菌產(chǎn)生的纖維小體具有高效降解木質(zhì)纖維素的特性,使其成為CBP構(gòu)制的一種新嘗試。本文以此為出發(fā)點,針對分泌途徑的各個關(guān)鍵節(jié)點,進行改造,提高纖維素酶等蛋白的分泌效率,以發(fā)掘不同異源蛋白高效分泌適配元件。在此基礎(chǔ)上,進行釀酒酵母人造纖維小體的設(shè)計和構(gòu)建。本論文主要研究工作有：1、釀酒酵母高活性分泌p-葡萄糖苷酶促進同步糖化發(fā)酵產(chǎn)生乙醇纖維素水解的中間產(chǎn)物纖維二糖對纖維素酶的水解活性具有強烈的反饋抑制作用,從而降低纖維素的降解效率,限制乙醇轉(zhuǎn)化率。而及時轉(zhuǎn)化纖維二糖為葡萄糖并發(fā)酵為乙醇,可解除這種抑制。但許多真菌天然纖維素酶系中,水解纖維二糖的p-葡萄糖苷酶的活性較低。因此,將β-葡萄糖苷酶在釀酒酵母中高效表達,是促進木質(zhì)纖維素同步糖化發(fā)酵產(chǎn)生乙醇的有效策略之一。本研究首先比較了三種來源的p-葡萄糖苷酶在釀酒酵母中異源表達的胞外活性,選擇了具有最高分泌活性的扣囊覆膜胞酵母(Saccharomycopsis fibuligera)β-葡萄糖苷酶SF-BGL1。然后通過多種信號肽的比較,發(fā)現(xiàn)克魯維酵母(Kluyveromyces marxianus)菊粉酶(Inulp)的信號肽進一步促進了SF-BGL1胞外分泌,酶活達到了6.22 U/mL。SF-BGL1的高活性表達,使釀酒酵母高效代謝纖維二糖,且纖維二糖的發(fā)酵特性與葡萄糖基本相似。缺乏β-葡萄糖苷酶活性的瑞氏木霉(Trichoderma reesei)纖維素酶系,與高效分泌SF-BGL1的酵母菌株進行同步糖化發(fā)酵微晶纖維素時,解除了纖維二糖的積累,使乙醇的產(chǎn)量比對照菌株(表達空質(zhì)粒)提高了105%。更為重要的是,以酸預(yù)處理的玉米芯為同步糖化發(fā)酵底物,高效分泌SF-BGL1的菌株發(fā)酵產(chǎn)生的乙醇產(chǎn)量達到了21.5g/L,與對照菌株相比,提高了89%,并且,其發(fā)酵液中剩余總糖量下降了71%。本研究獲得的高效BGL1分泌菌株,回補了瑞氏木霉纖維素酶系的不足,對提高木質(zhì)纖維素同步糖化發(fā)酵產(chǎn)生乙醇的得率具有重要的應(yīng)用價值。2、改造蛋白折疊和蛋白易位途徑提高異源蛋白在釀酒酵母中的表達異源蛋白β-葡萄糖苷酶BGL1、內(nèi)切葡聚糖酶CelA和α-淀粉酶在釀酒酵母中分泌表達時,造成了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)非正確折疊蛋白響應(yīng),降低了蛋白的胞外分泌效率,因此增加蛋白正確折疊是提高蛋白分泌量的有效措施之一。我們超表達內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶Kar2p及Pdilp,發(fā)現(xiàn)協(xié)助蛋白折疊的分子伴侶Kar2p超表達后,只提高了BGL1的胞外活性,而促進二硫鍵正確形成的二硫鍵異構(gòu)酶Pdilp超表達后,使三種異源蛋白的胞外活性均增加,其中包括不含二硫鍵的CelA。 BGL1、CelA和α-淀粉酶分泌量分別提高53%、17%和90%,說明Pdilp可有效促進上述三種異源蛋白的分泌。新生肽鏈正確易位到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中參與蛋白折疊,對蛋白的高效分泌也具有重要作用。新生肽鏈正確易位有蛋白翻譯后易位和翻譯共易位兩種形式。超表達協(xié)助蛋白翻譯共易位過程的信號識別顆粒關(guān)鍵組分Srp54p和Srp14p,明顯提高了三種異源蛋白的胞外分泌量。Srp54p的超表達使BGL1、CelA和α-淀粉酶的酶活分別提高了56%、16%和52%,Srp14的超表達使其分別提高了44%、18%和38%。協(xié)助新生肽鏈正確折疊并參與其翻譯后易位過程的胞質(zhì)分子伴侶Ssalp,超表達后增加了BGL1的胞外活性。此外,蛋白的信號肽是蛋白易位過程中的重要影響因素。我們發(fā)現(xiàn),不同信號肽對于Srp54p、Srp14p和Kar2p、 Pdilp超表達菌株中的胞外分泌增加趨勢沒有太大影響。但在Ssalp超表達菌中,信號肽SF和Yap3引導(dǎo)分泌的BGL1胞外活性均被提高,而Suc2并沒有。同時,Ssalp能提高信號肽Yap3引導(dǎo)的BGL1胞外活性,卻不適用于其引導(dǎo)的α-淀粉酶高效分泌。這說明,翻譯共轉(zhuǎn)運相關(guān)組分對異源蛋白的高效表達具有普遍的適配作用,并且不受信號肽的影響；而翻譯后轉(zhuǎn)運相關(guān)系組分Ssalp對異源蛋白具有適配差異性,并且其適配作用受到信號的影響。蛋白折疊和蛋白易位雙重改造,具有一定的協(xié)同作用,能進一步的促進異源蛋白的分泌,其中Pdilp和Srp54p共同超表達后,使BGL1、CelA和α-淀粉酶的胞外分泌分別提高了72%,60%和103%。本研究首次實現(xiàn)了改造釀酒酵母蛋白易位途徑提高異源蛋白胞外分泌的策略,為優(yōu)化適配于異源蛋白表達的分泌途徑提供了價值性的參考思路。3、阻斷釀酒酵母高甘露糖糖基化修飾通過上調(diào)分泌途徑和改變細胞壁完整性增加異源蛋白的產(chǎn)量異源蛋白β-葡萄糖苷酶BGL1、內(nèi)切葡聚糖酶CelA和外切葡聚糖酶Cel7A在經(jīng)過釀酒酵母分泌途徑加工修飾的過程中,發(fā)生了高甘露糖糖鏈添加的N-糖基化修飾,該糖基化修飾可能或影響蛋白的生物活性,或降低蛋白的胞外分泌量。因此,研究不同糖基化修飾程度對異源蛋白分泌活性的影響對優(yōu)化分泌途徑具有重要的意義。在高爾基體高甘露糖糖鏈合成過程中,糖基轉(zhuǎn)移酶Ochlp負責添加第一個甘露糖到中心糖鏈上；Mnn9p參與大約10個α-1,6-甘露糖糖基基鏈的合成；Mnnlp負責最后甘露糖糖基的添加。敲除OCH1和MNN9,使分泌至胞外的BGL1、CelA和Cel7A的分子量顯著降低,大小接近理論分子量,同時,三種異源蛋白的胞外分泌活性也得到了大幅度增加。在OCH1敲除菌株中,BGL1、CelA和Ce17A胞外酶活分別提高了135%、102%和144%；在MNN9敲除菌株中,分別增加了156%、105%和230%。而敲除MNN1后,蛋白的分子量與野生型菌株基本一致,且只有BGL1的胞外活性提高了25%。這說明阻斷釀酒酵母蛋白的高甘露糖修飾,能提高異源蛋白的分泌活性。根據(jù)三種異源蛋白不同修飾程度的N-糖鏈去除前后的酶活變化,分析得出OCH1和MNN9敲除導(dǎo)致N-糖鏈截短并不能提高BGL1、CelA和Ce17A的比酶活。BGL1、CelA和Cel7A的胞外產(chǎn)量與酶活相一致的增加幅度,說明OCHl和MNN9敲除增加異源蛋白胞外活性的主要原因是蛋白產(chǎn)量的增加。進一步分析發(fā)現(xiàn),在OCH1和MNN9敲除菌株中,分泌途徑中一些關(guān)鍵節(jié)點的分泌元件的表達被上調(diào),其中包括參與蛋白折疊的基因KAR2和SSA1、蛋白降解的DERl和HRD3和膜泡運輸?shù)腂OS1、ERV25、SNC2和SSO1,并且這些基因的上調(diào)不依賴于IRE1/HAC1介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫響應(yīng)機制的調(diào)控。這說明敲除OCH1和MNN9增強了釀酒酵母的分泌能力,從而增加了異源蛋白的胞外分泌量。同時,OCHl和MNN9的敲除造成了細胞壁完整性的損傷,使菌株對剛果紅、熒光增白劑以及葡聚糖水解酶的敏感性增強,細胞壁中的甘露糖比例顯著下降,并且增加了細胞壁的孔隙度,促進了異源蛋白穿過細胞壁分泌到胞外。敲除OCH1和MNN9減緩了細胞的生長,通過超表達參與細胞完整性損傷響應(yīng)機制中的關(guān)鍵基因RHO1和PKCl,部分回補了細胞壁的損傷,并且略微恢復(fù)細胞的生長。本研究為糖基化改造與異源蛋白高效分泌的兼容性研究提供了新穎的視角。4、優(yōu)化釀酒酵母膜泡運輸提高胞外蛋白和表面展示蛋白的分泌量蛋白增量表達往往由于運輸能力的不足,使加工修飾好的蛋白或在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中,或在高爾基體中積累,最終導(dǎo)致被降解。增強內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基體和高爾基體-質(zhì)膜的膜泡運輸能力,對減少蛋白胞內(nèi)積累具有重要的作用。參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基體膜泡運輸?shù)脑ecl2p、Secl3p、Erv25p和Boslp超表達后,都能提高CelA的胞外分泌量,而其中,只有Secl3p使BGL1的胞外酶活增加了40%。同時,參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-質(zhì)膜膜泡運輸?shù)脑solp、Snc2p、Seclp、Exo70p、Sec4p和Ypt32p超表達后,都能促進BGL1的分泌活性,其中最為明顯的是相關(guān)膜泡與質(zhì)膜融合的SNAREs蛋白Ssolp和Snc2p,使BGL1酶活分別增加了53%和61%。而針對于CelA的胞外分泌,其中只有Snc2p、Sec4p、Ypt32p能略微提高其胞外活性(10%-15%)。實驗結(jié)果表明,膜泡運輸改造能促進異源蛋白的高效分泌,但是不同蛋白在膜泡運輸?shù)南拗乒?jié)點不同,CelA的主要限制在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基體的膜泡運輸,而BGL1的主要限制在高爾基體-質(zhì)膜的膜泡運輸。此外,表面展示蛋白也需要經(jīng)過分泌途徑的加工修飾。將CelA和BGL1通過釀酒酵母常用的并且已商業(yè)化的表面展示系統(tǒng)Aga1p-Aga2p錨定于細胞表面。通過酶活測定和流式細胞儀分析結(jié)果顯示,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基體和高爾基體-質(zhì)膜膜泡運輸?shù)母脑?都能提高CelA的表面展示效率,其中,Bos1p、Exo70p和Sec4最明顯,使CelA細胞酶活分別提高了71%、90%和51%。同時,BGL1的細胞酶活也都獲得了一定的提高。這說明,無論是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基體還是高爾基體-質(zhì)膜的膜泡運輸改造,都可以提高通過Aga1p-Aga2p展示的異源蛋白分泌。本研究分析了膜泡運輸改造對異源蛋白胞外分泌的影響,并首次研究其對細胞表面展示蛋白的影響,發(fā)現(xiàn)不同蛋白在運輸環(huán)節(jié)的限制節(jié)點不同,對優(yōu)化分泌途徑提供了重要的參考建議。釀酒酵母纖維小體的構(gòu)建是CBP的研究熱點。在釀酒酵母中,纖維小體的構(gòu)制需要實現(xiàn)支架蛋白和至少三種酶組分的異源表達。因此,將來源于熱線梭菌初級支架蛋白CipA上的三個粘連模塊和底物結(jié)合模塊(CBM)作為微型支架蛋白ScafCipA3,通過凝集素(Aga1-Aga2p)表面展示系統(tǒng),成功的展示于釀酒酵母細胞表面,且展示百分率達到40%。同時,將扣囊覆膜胞酵母的BGL1(具有較高表達活性,見摘要1)融合上熱纖梭菌木聚糖酶XynC的對接模塊作為纖維小體降解纖維二糖的酶組分。為了獲得具有高活性的另外兩個酶組分,比較不同來源外切葡聚糖酶和內(nèi)切葡聚糖酶融合相應(yīng)對接模塊的表達酶活,其中,埃默森籃狀菌(Talaromyces emersonii)的外切葡聚糖酶CBH1中具有最高的分泌活性,同時,熱纖梭菌的內(nèi)切葡聚糖CelA具有較高的分泌活性。這些酶組分通過對接模塊與粘連模塊的作用,成功的自組裝到釀酒酵母細胞表面的支架蛋白上,CBH1、CelA和BGL1的自組裝百分率分別3.8%、19.3%和2.5%。當提高酶組分的濃度,降低支架蛋白表達菌濃度后,CBH1、CelA和BGL1的自組裝百分率明顯增加了,分別達到了7.4%、94.3%和9.0%。微型纖維小體可直接利用磷酸膨脹纖維素(PASC)產(chǎn)生的乙醇,但產(chǎn)量較低。本研究提出了酶組分的表達量不足是纖維小體自組裝效率低的限制性因素之一,為優(yōu)化纖維小體的策略提供了思路。6、釀酒酵母通過二硫鍵自組裝新型纖維小體及其復(fù)雜化的構(gòu)制纖維小體是通過酶組分上的對接模塊與支架蛋白上的粘連模塊相互作用,自組裝形成的蛋白復(fù)合物。蛋白與蛋白間的相互作用包括多種方式,例如抗原抗體作用、通過二硫鍵的相互作用等,是豐富纖維小體自組裝方式極具潛力的工具蛋白。釀酒酵母凝集素a是由亞基Aga1p和Aga2p便是通過二硫鍵相互作用形成的蛋白復(fù)合物,其中,Aga1p的1-149氨基酸結(jié)構(gòu)域(命名為AGA)主要負責與Aga2p形成二硫鍵。基于凝集素a的形成方式,我們將Aga1p的1-149氨基酸結(jié)構(gòu)域作為粘連模塊,Aga2p作為對接模塊,設(shè)計了通過二硫鍵實現(xiàn)自組裝的新型微型纖維小體。由三個AGA與T. reesei外切葡聚糖酶的CBM融合形成的支架蛋白ScafAGA3,能夠成功的通過Agalp的糖磷脂酰肌醇功能結(jié)構(gòu)域展示于釀酒酵母的細胞表面,并且細胞的展示百分率達到了56%,明顯高于熱纖梭菌源的支架蛋白(約40%,見摘要5)。Aga2p與外切葡聚糖酶、內(nèi)切葡聚糖酶和p-葡萄糖苷酶融合作為纖維小體酶組分aCBH1、aCelA和aBGL1,都能在釀酒酵母中實現(xiàn)活性表達。利用細胞壁蛋白Sedlp展示AGA,與aCelA共表達后能發(fā)生自組裝,且自組裝的百分率為11.7%,說明AGA能夠發(fā)揮粘連模塊的功能。aCBH1、aCelA和aBGL1分別與支架蛋白ScafAGA3共表達后,在細胞表面的自組裝百分比分別是12.1%、28.3%和5.8%。通過二硫鍵自組裝的新型纖維小體,利用PASC限氧發(fā)酵,能夠產(chǎn)生0.925g/L的乙醇,比對照菌株(不表達支架蛋白)提高了50%。進而,將ScafAGA3作為錨定支架蛋白,熱纖梭菌源支架蛋白ScafCipA3作為初級支架蛋白,使初級支架蛋白通過二硫鍵自組裝到錨定支架蛋白上,再將纖維素酶酶組分通過對接模塊-粘連模塊作用方式自組裝到初級支架蛋白上,形成具有雙層支架蛋白的纖維小體結(jié)構(gòu)。CBH1、CelA和BGL1能成功的實現(xiàn)與初級支架蛋白的自組裝,但是自組裝百分率較低,而通過增加酶組分濃度,降低支架蛋白表達菌濃度,可明顯增加三種酶組分的自組裝細胞百分率,分別達到8.3%、99%和14.2%。雙支架蛋白纖維小體利用PASC產(chǎn)生的乙醇產(chǎn)量為0.5 g/L。本論文通過分泌途徑各個環(huán)節(jié)的改造和優(yōu)化,包括蛋白折疊、新生肽鏈易位、蛋白糖基化、膜胞運輸?shù)拳h(huán)節(jié)的改造,提高纖維素酶等蛋白的分泌,發(fā)現(xiàn)蛋白糖基化的改造對于不同的蛋白具有普適性,而蛋白折疊、新生肽鏈易位、膜胞運輸環(huán)節(jié)的改造具有蛋白特異性,發(fā)現(xiàn)了不同蛋白分泌的限制節(jié)點的差異,發(fā)掘了異源蛋白分泌的適配元件。在此基礎(chǔ)上,構(gòu)建了基于二硫鍵自組裝的釀酒酵母新型纖維小體,克服了傳統(tǒng)纖維小體展示效率低的問題。而本論文分泌途徑的研究,也為進一步提高纖維小體關(guān)鍵組分的分泌和展示提供了堅實的理論基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：TS261.11;Q78

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前2條

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本文編號：2084065