本文選題：PFK-1 + 神經發(fā)生��； 參考：《南京醫(yī)科大學》2016年博士論文

【摘要】：神經發(fā)生是指神經干細胞經歷增殖及不對稱分裂產生神經前體細胞,并向不同的功能性區(qū)域遷移、分化,最終整合進入神經環(huán)路中發(fā)揮生理功能的過程,也是成年大腦可塑性的意義所在。在成年哺乳動物的中樞神經系統(tǒng)中,神經發(fā)生主要存在于兩個區(qū)域,即海馬齒狀回的顆粒細胞下層和側腦室的室管膜下區(qū)。側腦室室管膜下區(qū)的神經前體細胞經過增殖和分化,沿著嘴側遷移流以鏈式模式遷移至嗅球并分化成為中間神經元；而海馬齒狀回下區(qū)的神經干細胞則經過短距離遷移至顆粒細胞下層分化為顆粒細胞,并通過苔蘚纖維向海馬CA3區(qū)發(fā)出軸突投射,建立突觸聯(lián)系,最終整合到海馬神經環(huán)路中發(fā)揮學習記憶等功能。由于海馬神經發(fā)生與學習、記憶和情感等高級認知功能密切相關,因此關于該區(qū)域神經發(fā)生及相關的分子機制在近些年來受到了廣泛的關注和研究。磷酸果糖激酶-1(Phosphofructokinase-1,PFK-1)是糖酵解過程中重要的限速酶,主要通過磷酸化6-磷酸果糖生成ADP和1,6-雙磷酸果糖,在無氧狀態(tài)下為機體提供能量。以往研究證實PFK-1和腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程密切相關,并有望成為腫瘤治療的新靶點。在中樞神經系統(tǒng)中,PFK-1對星形膠質細胞及神經元的功能也發(fā)揮著不同的作用。然而,關于PFK-1和中樞神經系統(tǒng)中另一個細胞群,神經干細胞之間的聯(lián)系則迄今未見研究報道。因此,本文展開了以下三方面的研究,第一：探究生理條件下,胚胎神經干細胞中PFK-1是否參與對神經發(fā)生的調節(jié),且該調節(jié)作用是通過何種途徑實現(xiàn)的；第二：探討缺氧后PFK-1的表達變化及其對神經發(fā)生的影響；第三：闡釋不同條件下PFK-1調節(jié)神經發(fā)生的分子機制。第一章生理狀態(tài)下PFK-1對神經發(fā)生的調控作用為了探究生理狀態(tài)下PFK-1對神經干細胞生物學行為的影響,本研究構建了兩種慢病毒載體,分別攜帶PFK-1 shRNA和PFK-1基因全長以干擾和過表達PFK-1。將成功感染慢病毒的神經干細胞貼壁分化,4天后取出進行β-Ⅲ-Tubulin(神經元特異性標志物)的免疫熒光標記。結果顯示,和LV-Control-shRNA組相比,LV-PFK-1-shRNA(干擾PFK-1表達)可顯著促進神經干細胞向神經元的分化水平,增加新生神經元中多突起神經元的比例；相反,LV-PFK-1-GFP(過表達PFK-1)則逆轉了這種神經元分化水平的升高趨勢,多突起神經元分化比例也明顯降低,這說明生理條件下,PFK-1是調節(jié)神經元分化及發(fā)育的重要分子。同時,結果顯示干擾PFK-1表達后,巢蛋白Nestin+(神經干細胞標志物)細胞比例顯著降低,增殖培養(yǎng)條件下的Nestin+細胞呈散在均勻的分布,而空病毒組細胞則趨向于呈神經球樣聚集生長,這提示干擾神經干細胞中PFK-1的表達不利于其干細胞樣特性的維持。以上結果證明,生理狀態(tài)下PFK-1可負調控神經干細胞向神經元的分化和樹突的發(fā)育,并參與干細胞樣特性的維持。為了進一步證實PFK-1對神經干細胞的調節(jié)作用,本研究通過立體定位向小鼠海馬齒狀回區(qū)(Dentate gyrus, DG)微量注射慢病毒(LV-PFK-1-shRNA和LV-Control-shRNA),第4天腹腔注射BrdU (5-bromo-2'-deoxyuridine)以標記新生細胞,第14天通過免疫熒光檢測GFP/BrdU/DCX的表達。經分析發(fā)現(xiàn)和體外實驗結果一致,與]LV-Control-shRNA相比,LV-PFK-1-shRNA可顯著升高GFP+/BrdU+/DCX+新生神經元的比例,同時增加DG區(qū)GFP+BrdU+新生細胞數(shù)。上述結果表明,體內干擾PFK-1表達可促進神經前體細胞增殖,誘導神經干細胞分化為神經元。在以上整體動物實驗中,慢病毒非特異性的感染DG區(qū)所有細胞(包括神經元、膠質細胞),可能對上述結果造成干擾。為了排除這種非細胞特異性感染帶來的影響,本文統(tǒng)計了未被病毒感染的神經干細胞的神經發(fā)生水平。結果顯示,GFP-/BrdU+/DCX+新生神經元比例及GFP-/BrdU+新生細胞數(shù)在兩組間(LV-Control-shRNA和LV-PFK-1-shRNA)均無顯著差異,提示這部分未被感染的神經干細胞的功能并未受周圍因素(非細胞特異性的PFK-1干擾)的影響。因此可推斷,這種非細胞特異性的感染并不影響以上干擾PFK-1表達促進神經發(fā)生的結果。以上結果已證實干擾PFK-1表達可促進神經發(fā)生,而引起神經發(fā)生增強的因素可能有三種,第一：促進神經元(前體細胞)的存活或降低其死亡率；第二：促進神經前體細胞增殖；第三：誘導神經干細胞向神經元方向分化。首先,為了確證干擾PFK-1表達所介導的神經發(fā)生是否通過作用于前兩種因素實現(xiàn)的,本文將成功轉染慢病毒(LV-Control-shRNA和LV-PFK-1-shRNA)的神經干細胞進行貼壁分化,并摻入BrdU和Hoechst分別標記增殖和死亡的細胞。結果顯示和空病毒組相比,干擾PFK-1表達可顯著增加BrdU+細胞比例,對細胞死亡率并無顯著影響,說明干擾PFK-1表達可促進神經前體細胞增殖,但對細胞存活并無改善作用。其次,通過引入數(shù)學描述的方法分析第三個因素,即干擾PFK-1表達對神經干細胞命運選擇的影響。假設分化過程中死亡的細胞全部都是神經元或全都不是神經元,可分別得到神經前體細胞(β-Ⅲ-Tubulin-)向神經元(β-Ⅲ-Tubulin+)分化的最小分化率(βmin)和最大分化率(βmax)。結果顯示,和LV-Control-shRNA組相比,分化第四天LV-PFK-1-shRNA組神經干細胞向神經元的分化率(βmin和βmax)均顯著升高。綜合以上結果可知,干擾PFK-1表達可通過促進神經前體細胞增殖,誘導神經干細胞定向分化為神經元而促進神經發(fā)生,對細胞的存活并無顯著影響。第二章 缺氧狀態(tài)下PFK-1對神經發(fā)生的調控作用本章研究主要探討缺氧后PFK-1的表達變化及該條件下PFK-1對神經元分化水平的影響。結果顯示,缺氧3 h、4h和5 h后神經干細胞中PFK-1的表達水平顯著升高,并具有一定的時間依賴性,說明缺氧可促進PFK-1表達。此后,將缺氧5 h后的神經干細胞繼續(xù)分化,4天后取出進行免疫熒光標記。結果顯示,和Control組相比,缺氧后β-Ⅲ-Tubulin的陽性細胞率并無顯著變化,這和生理條件下過表達PFK-1抑制神經元分化的現(xiàn)象并不一致。經分析可能是缺氧激活了某些調節(jié)神經發(fā)生的信號傳導通路,從而拮抗PFK-1升高對神經元分化的抑制效應。此外,和空病毒組相比,缺氧狀態(tài)下干擾PFK-1表達后,β-Ⅲ-Tubulin陽性細胞比例顯著升高,新生神經元中多突起神經元的數(shù)目也明顯增加,這提示缺氧后干擾PFK-1可促進神經干細胞向神經元的分化和樹突的發(fā)育；而過表達PFK-1則逆轉了這種現(xiàn)象。綜上所述,缺氧后PFK-1可反向調控神經干細胞向神經元的分化,不利于神經元的發(fā)育。第三章PFK-1調節(jié)神經發(fā)生的分子機制本章在細胞水平上初步研究了不同條件下PFK-1調節(jié)神經發(fā)生的分子機制。首先,通過Western blotting法檢測生理狀態(tài)下分化6h后神經干細胞中Mash 1、NeuroD和Sox2的蛋白表達水平。結果顯示,和LV-Control-shRNA相比,LV-PFK-1-shRNA可顯著促進Mash 1、NeuroD和Sox2的表達,而這種現(xiàn)象可被過表達PFK-1所逆轉,這提示Mash 1、NeuroD和Sox2可能參與了PFK-1所介導的神經發(fā)生過程。其次,對缺氧6h后的神經干細胞進行Western blotting分析發(fā)現(xiàn),和生理狀態(tài)下一致,干擾PFK-1后Mash 1、NeuroD和Sox2的蛋白表達水平均顯著升高,而過表達PFK-1則降低了以上三種轉錄因子的表達水平。以上實驗結果證明,Mash 1、NeuroD和Sox2可能參與了生理狀態(tài)下及缺氧后PFK-1對神經發(fā)生的調節(jié)過程。最后,本研究探討了PFK-1是否通過Wnt/β-catenin信號通路調節(jié)上述轉錄因子,進而調控神經發(fā)生,并最終證實PFK-1對神經發(fā)生的調節(jié)并不依賴于Wnt/β-catenin信號通路。綜合以上結果可得到如下結論：(1)生理狀態(tài)下,PFK-1可通過調節(jié)神經前體細胞的增殖及神經干細胞的命運選擇而負調控神經發(fā)生。(2)缺氧后,PFK-1可負調控神經干細胞向神經元的分化及新生神經元的發(fā)育；(3)PFK-1對神經發(fā)生的調節(jié)可能是通過調節(jié)相關轉錄因子實現(xiàn)的。
[Abstract]:In the central nervous system of adult mammals , neurogenesis mainly exists in the central nervous system of adult mammals .
In the central nervous system , PFK - 1 and PFK - 1 play a different role in the development of astrocytes and neurons . However , in the central nervous system , PFK - 1 is closely related to the development of astrocytes and neurons , and it is expected to be a new target for tumor therapy .
Second : To investigate the expression of PFK - 1 after hypoxia and its effect on neurogenesis ;
In the first chapter , the effects of PFK - 1 shRNA and PFK - 1 gene on the biological behavior of neural stem cells were studied . The results showed that LV - PFK - 1 - shRNA ( interfering PFK - 1 expression ) could significantly promote the differentiation of neural stem cells to neurons and increase the proportion of multi - protruding neurons in neonatal neurons compared with LV - control - shRNA group .
The results showed that PFK - 1 could stimulate the proliferation of neural stem cells and induce neural stem cells to differentiate into neurons .
secondly , promoting the proliferation of the neural progenitor cells ;
The results showed that the expression of PFK - 1 and PFK - 1 increased significantly after hypoxia for 3 h , 4 h and 5 h .
In conclusion , the results showed that the expression of Mash 1 , NeuroD and Sox2 in neural stem cells could be regulated by Western blotting . The results showed that Mash 1 , NeuroD and Sox2 might participate in the neurogenesis induced by PFK - 1 .
( 3 ) The regulation of neurogenesis by PFK - 1 may be achieved by regulating the relevant transcription factors .
【學位授予單位】：南京醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：Q42

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本文編號：2067381