本文選題：間充質(zhì)干細(xì)胞 + miRNAs　； 參考：《華中農(nóng)業(yè)大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells, MSCs)是具有不斷自我更新和多向分化潛能的基質(zhì)細(xì)胞。在特定的誘導(dǎo)條件下,這些細(xì)胞能夠分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等。因此,在細(xì)胞再生醫(yī)學(xué)上具有重要的臨床意義。然而,調(diào)控間充質(zhì)干細(xì)胞命運(yùn)(細(xì)胞增殖、分化、凋亡)的分子機(jī)制尚不明確。miRNAs是內(nèi)源性長度約為22 nt的單鏈RNA分子,通過靶向基因3'UTR調(diào)控其表達(dá)。近期研究表明,miRNAs參與調(diào)控多種生理生化過程,其中包括細(xì)胞增殖、分化以及凋亡。miR-144-3p是一個(gè)典型的癌癥抑制因子且參與多種癌癥或腫瘤細(xì)胞的增殖調(diào)控。然而,截止目前,還沒有關(guān)于miR-144-3p調(diào)控間充質(zhì)干細(xì)胞增殖與分化的文獻(xiàn)報(bào)道。因此,本研究主要通過功能“獲得”和“缺失”、雙熒光素酶報(bào)告基因檢測、熒光定量PCR、 Western blotting、實(shí)時(shí)細(xì)胞分析以及流式細(xì)胞等方法對miR-144-3p在間充質(zhì)干細(xì)胞增殖、分化以及凋亡過程中的作用進(jìn)行了研究,主要研究結(jié)果如下：1. miR-144-3p對間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的調(diào)控作用在小鼠C3H10T1/2細(xì)胞成骨分化過程中,成骨分化標(biāo)志基因(Runx2、OCN和Osx)的表達(dá)量逐漸升高。而miR-144-3p的表達(dá)量則逐漸降低,到誘導(dǎo)成骨21d的時(shí)候達(dá)到最低。這表明miR-144-3p可能參與調(diào)控小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化過程。將miR-144-3p mimics(或者是其陰性對照)轉(zhuǎn)染到C3H10T1/2細(xì)胞中,然后誘導(dǎo)成骨分化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-144-3p mimics轉(zhuǎn)染組細(xì)胞成骨分化顯著受到抑制,ALP以及茜素紅染色和定量結(jié)果均顯示：miR-144-3p mimic s轉(zhuǎn)染組細(xì)胞ALP活性降低、鈣結(jié)節(jié)形成受到抑制。另外,qRT-PCR和Western blotting結(jié)果也表明：miR-144-3p mimics轉(zhuǎn)染組細(xì)胞成骨分化標(biāo)志基因Runx2、OCN以及Osx的表達(dá)量顯著下降。相應(yīng)地,我們將miR-144-3p inhibitor(或者是其陰性對照)轉(zhuǎn)染C3H10T1/2細(xì)胞,然后誘導(dǎo)成骨分化,結(jié)果與轉(zhuǎn)染miR-144-3p mimics呈現(xiàn)相反的趨勢。因此,miR-144-3p抑制C3H10T1/2細(xì)胞成骨分化。通過多種靶基因預(yù)測軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)：Smad4可能是miR-144-3p的靶基因。雙熒光素酶報(bào)告試驗(yàn)、qRT-PCR、Western blotting進(jìn)一步證實(shí),miR-144-3p直接靶向Smad4 3'UTR,且在轉(zhuǎn)錄后水平抑制其表達(dá)。進(jìn)一步研究靶基因Smad4功能發(fā)現(xiàn)：①在C3H10T1/2細(xì)胞中超表達(dá)Smad4能夠促進(jìn)其成骨分化,而抑制Smad4表達(dá)則會(huì)抑制C3H10T1/2細(xì)胞成骨分化。②在C3H10T1/2細(xì)胞中,通過si-Smad4抑制Smad4表達(dá)將會(huì)阻斷miR-144-3p inhibitor對于C 3H10T1/2細(xì)胞成骨分化的促進(jìn)作用。這也進(jìn)一步表明,Smad4作為miR-144-3p的靶基因,是連接miR-144-3p與C3H10T1/2細(xì)胞成骨分化的橋梁。因此,miR-144-3p是通過靶向調(diào)控Smad4來抑制C3H10T1/2細(xì)胞成骨分化的。2. miR-144-3p對間充質(zhì)干細(xì)胞成脂分化的調(diào)控作用在C3H10T1/2細(xì)胞成脂分化過程中,成脂分化標(biāo)志基因(C/EBPα、C/EBPβ、 PPARy以及AP2)的表達(dá)量逐漸升高,而且miR-144-3p的表達(dá)量也隨著成脂分化過程逐漸升高,到誘導(dǎo)成脂8d的時(shí)候達(dá)到最高。這表明niR-144-3p可能參與調(diào)控小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞成脂分化過程。將miR-144-3p mimics(或者是其陰性對照)轉(zhuǎn)染到C3H10T1/2細(xì)胞中,然后誘導(dǎo)成脂分化。結(jié)果發(fā)現(xiàn),miR-144-3p mimics促進(jìn)細(xì)胞成脂分化。miR-144-3p mimics轉(zhuǎn)染組油紅O染色結(jié)果比陰性對照組要顯著升高,同時(shí)成脂分化標(biāo)志基因C/EBPα、 C/EBPβ、PPARy以及AP2的表達(dá)量也明顯升高。相應(yīng)地,我們將miR-144-3p inhibitor(或者是其陰性對照)轉(zhuǎn)染到C3H10T1/2細(xì)胞中,然后誘導(dǎo)成脂分化,結(jié)果與轉(zhuǎn)染miR-144-3p mimics呈現(xiàn)相反的趨勢。這些結(jié)果表明：miR-144-3p促進(jìn)C3H10T1/2細(xì)胞成脂分化。通過多種靶基因預(yù)測軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)：bmp-3b可能是miR-144-3p調(diào)控成脂分化過程中靶向的基因。雙熒光素酶報(bào)告試驗(yàn)、qRT-PCR、Western blotting進(jìn)一步證實(shí),miR-144-3p直接靶向bmp-3b的3'UTR,且在轉(zhuǎn)錄以及轉(zhuǎn)錄后水平抑制其表達(dá)。3. miR-144-3p對間充質(zhì)干細(xì)胞增殖和凋亡的調(diào)控作用將]miR-144-3p mimics(或者是其陰性對照)轉(zhuǎn)染到C3H10T1/2細(xì)胞中,然后通過實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀監(jiān)測細(xì)胞增殖情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn),miR-144-3p mimics顯著抑制細(xì)胞增殖。相應(yīng)地,我們將miR-144-3p inhibitor(或者是其陰性對照)轉(zhuǎn)染到C3H10T1/2細(xì)胞中,實(shí)時(shí)細(xì)胞分析結(jié)果與轉(zhuǎn)染miR-144-3p mimics呈現(xiàn)相反的趨勢。通過流式分析進(jìn)一步證實(shí)了miR-144-3p對C3H10T1/2細(xì)胞增殖的負(fù)調(diào)控作用：在轉(zhuǎn)染了miR-144-3p mimics后,G0/G1期細(xì)胞顯著增多,而S期細(xì)胞顯著減少,這表明miR-144-3p mimics會(huì)阻滯C3H10T1/2細(xì)胞于G0/G1期：而轉(zhuǎn)染niR-144-3pinhibito r則得到相反的結(jié)果。因此,miR-144-3 P通過阻滯C3H10T1/2細(xì)胞于G0/G1期,抑制C3H10T1/2細(xì)胞增殖。已經(jīng)證實(shí),miR-144-3p靶向抑制Smad4基因。進(jìn)一步研究靶基因Smad4功能發(fā)現(xiàn)：①在C3H10T1/2細(xì)胞中超表達(dá)Smad4能夠促進(jìn)其增殖,而抑制Smad4表達(dá)則會(huì)抑制C3H10T1/2細(xì)胞增殖。②在C3H10T1/2細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染si-Smad4與miR-144-3p inhibitor, miR-144-3p inhibitor對于C3H10T1/2細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用消失。這也進(jìn)一步表明,niR-144-3p通過靶向調(diào)控Smad4抑制C3H10T1/2細(xì)胞增殖。為探究miR-144-3p對于C3H10T1/2細(xì)胞凋亡的影響,我們將1miR-144-3p mimics(或者是miR-144-3p inhibitor)轉(zhuǎn)染到C3H10T1/2細(xì)胞中,通過流式分析轉(zhuǎn)染后細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn),miR-144-3p mimics和miR-144-3p inhibitor都不影響C3H10T1/2細(xì)胞凋亡。同時(shí),我們檢測凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)發(fā)現(xiàn)niR-144-3p也不影響凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。因此,我們推斷miR-144-3p對間充質(zhì)干細(xì)胞凋亡不起作用。綜上所述,本研究的結(jié)論是：① miR-144-3p通過靶向Smad4抑制C3H10T1/2細(xì)胞成骨分化,Smad4基因促進(jìn)C3H10T1/2細(xì)胞成骨分化過程；②miR-144-3p通過靶向bmp-3b促進(jìn)C3H10T1/2細(xì)胞成脂分化；③miR-144-3p通過靶向Smad4抑制C3H10T1/2細(xì)胞增殖,Smad4基因促進(jìn)C3H10T1/2細(xì)胞增殖過程：④miR-144-3p不影響C3H10T1/2細(xì)胞凋亡。
[Abstract]:However , there is no literature report on the proliferation , differentiation and apoptosis of the mesenchymal stem cells by targeting gene 3 ' . However , the present study has not yet done a study on the role of miR - 144 - 3P in the proliferation , differentiation and apoptosis of mesenchymal stem cells . Conclusion : The expression of miR - 144 - 3P can promote the differentiation of bone differentiation in C3H10T1 / 2 cells . The results also show that miR - 144 - 3P can be involved in regulating bone differentiation in C3H10T1 / 2 cells . The results showed that miR - 144 - 3P may be involved in the regulation and regulation of adipogenesis in C3H10T1 / 2 cells . The results show that miR - 144 - 3P can be involved in the regulation of adipogenesis in C3H10T1 / 2 cells . The results showed that miR - 144 - 3P inhibited the proliferation of C3H10T1 / 2 cells by targeting Smad4 . The results showed that miR - 144 - 3P inhibited the proliferation of C3H10T1 / 2 cells .
( 2 ) miR - 144 - 3P promotes the differentiation of C3H10T1 / 2 cells through targeting bmp - 3b ;
( 3 ) miR - 144 - 3P inhibits the proliferation of C3H10T1 / 2 cells by targeting Smad4 , and the Smad4 gene promotes the proliferation of C3H10T1 / 2 cells : ( 4 ) miR - 144 - 3P does not influence the apoptosis of C3H10T1 / 2 cells .
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：Q23

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本文編號：2065681