發(fā)布時(shí)間：2018-05-25 20:31

  本文選題：減數(shù)分裂 + p-CDK2��； 參考：《中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：隨著工業(yè)化程度的提高、環(huán)境污染的加劇和生活工作壓力的加大,不孕不育正在越來(lái)越嚴(yán)重的困擾眾多的家庭,并已然成為了人類社會(huì)面臨的一個(gè)重要問(wèn)題。值得注意的是,不育癥發(fā)病的概率正在呈現(xiàn)逐年上升趨勢(shì),在適齡人群中估計(jì)占15%,并且其中男性方面的因素占到了一半左右。而且在男性不育癥患者中,高達(dá)60-75%的患者其發(fā)病機(jī)制不明,這就為男性不育的治療帶來(lái)了很多的困惑。因此,明確男性不育發(fā)生的原因和分子機(jī)制迫在眉睫。精子發(fā)生是一個(gè)復(fù)雜而又精確的生殖細(xì)胞分化的過(guò)程,它經(jīng)歷了精原細(xì)胞有絲分裂、精母細(xì)胞減數(shù)分裂和精子細(xì)胞的變形3個(gè)關(guān)鍵的階段并最終形成了成熟的有功能的精子。減數(shù)分裂Ⅰ期是一個(gè)相當(dāng)特殊的過(guò)程,在精子發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用,減數(shù)分裂進(jìn)程一旦出錯(cuò)精子發(fā)生就會(huì)停滯并最終導(dǎo)致不育。減數(shù)分裂進(jìn)程中,同源染色體的配對(duì)、聯(lián)會(huì)和同源染色體重組是其關(guān)鍵事件。在正常的減數(shù)分裂過(guò)程中,哺乳動(dòng)物的X染色體和Y染色體卻只有在部分區(qū)域保持有同源性,只能這個(gè)局部區(qū)域配對(duì),而在大部分區(qū)域保持不聯(lián)會(huì),這種不聯(lián)會(huì)事件會(huì)觸發(fā)性染色體相關(guān)基因在減數(shù)分裂粗線期階段表達(dá)沉默,也被稱之為減數(shù)分裂性染色體沉默(meiotic sex chromosome inactivation, MSCI), MSCI保證了減數(shù)分裂的順利進(jìn)行,對(duì)于雄性動(dòng)物生育有著非常重要不可或缺的作用,MSCI的異常會(huì)導(dǎo)致精子發(fā)生停滯在粗線期這個(gè)階段。CDK2作為重要的細(xì)胞周期調(diào)控的蛋白激酶,在哺乳動(dòng)物減數(shù)分裂過(guò)程的同源染色體行為中同樣扮演至關(guān)重要的角色,特別是在同源染色體的重組和配對(duì)以及sex body形成中起關(guān)鍵作用。但是就磷酸化CDK2 (p-CDK2)而言,特別是第160位點(diǎn)的蘇氨酸磷酸化的CDK2 (p-CDK239)是否在減數(shù)分裂中的發(fā)揮重要的功能至今未見(jiàn)有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。我們研究發(fā)現(xiàn),p-CDK2能高度特異的定位到未配對(duì)的常染色體和sex body,并且能和參與MSCI功能的關(guān)鍵蛋白γ-H2AX相互作用,并且這種相互作用是依賴蘇氨酸160磷酸化位點(diǎn)的,定點(diǎn)突變Thr 160會(huì)干擾兩蛋白的相互作用,同時(shí)我們發(fā)現(xiàn),在CDK2的兩個(gè)亞型中,只有亞型1(CDK239)能特異的和γ-H2AX相互作用,并且我們實(shí)驗(yàn)也推斷出只有CDK239定位在sex body。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn),在下調(diào)磷酸化CDK2在sex body的水平后,MSCI異常,性染色體基因活化,提示p-CDK2會(huì)參與MSCI�；魻柕し▌t法則指出：當(dāng)兩種異種生物相互交配時(shí)所產(chǎn)生的雜種一代中有某一個(gè)性別的個(gè)體不能夠成活或不育的話,那一定這兩種生物一定是異配的性別(heterogametic sex)。無(wú)論在動(dòng)物或者植物中,雜交不育都廣泛存在,并且這也是配子結(jié)合后生殖隔離的重要機(jī)制。在雜交不育小鼠中,通常表現(xiàn)出雄性不育,伴隨有精子發(fā)生異常,導(dǎo)致精子數(shù)目下降或者精子畸形。盡管由精子發(fā)生遭到破壞導(dǎo)致的生殖隔離現(xiàn)象已經(jīng)廣為人知,但是其潛在的遺傳機(jī)制和分子基礎(chǔ)依然不得而知。其中一個(gè)驅(qū)動(dòng)雜交雄性不育形成的假說(shuō)被稱之為“減數(shù)分裂驅(qū)動(dòng)力”。在研究中我們發(fā)現(xiàn),當(dāng)我們使用不同品系的兩種小鼠(PWK/Ph and C57BL/6J)進(jìn)行交配時(shí),后代的可育性明顯不同。如果將PWK小鼠作為母本,F1代的雄鼠是不育的：如果將C57的小鼠作為母本,Fl代的雄鼠是可育的。并且我們?cè)谘芯恐邪l(fā)現(xiàn),這個(gè)雜交后不育的Fl代雄性小鼠精子發(fā)生會(huì)停滯在粗線期精母細(xì)胞中期,而且還伴隨著很多的生殖細(xì)胞出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象。而且,不育小鼠出現(xiàn)了很多的減數(shù)分裂事件異�，F(xiàn)象,如同源染色體聯(lián)會(huì)異常、性染色體配對(duì)異常、常染色體和性染色體間的行為異常等等。因?yàn)闇p數(shù)分裂過(guò)程需要眾多蛋白的參與,所以為了確定造成雜交雄性不育的蛋白分子機(jī)制,我們通過(guò)密度梯度方法分離出了雜交不育F1和雜交可育F1代的粗線期精母細(xì)胞,提取其中的蛋白進(jìn)行二維電泳檢測(cè)兩者之間差異表達(dá)的蛋白,來(lái)確定這些蛋白是如何協(xié)同調(diào)節(jié)雜交不育過(guò)程的。分析質(zhì)譜結(jié)果我們發(fā)現(xiàn),在總共4005個(gè)檢測(cè)到得蛋白中,有215個(gè)蛋白表達(dá)是上調(diào)的,381個(gè)蛋白表達(dá)是下調(diào)的。通過(guò)對(duì)蛋白質(zhì)組學(xué)的生物信息學(xué)分析,我們發(fā)現(xiàn)43個(gè)蛋白對(duì)減數(shù)分裂過(guò)程非常重要,59個(gè)蛋白對(duì)精子發(fā)生過(guò)程至關(guān)重要。并且通過(guò)生物信息學(xué)分析,我們發(fā)現(xiàn)這些蛋白之間可能存在潛在的直接相互作用和相互調(diào)節(jié)的關(guān)系。通過(guò)分析雜交不育小鼠的粗線期細(xì)胞蛋白質(zhì)組,對(duì)于我們了解雜交雄性不育和減數(shù)分裂過(guò)程有一定的指導(dǎo)意義。生殖、脂肪代謝和壽命是相互聯(lián)系的,眾多研究表明生殖過(guò)程能夠影響脂肪代謝和壽命。在許多物種中,剔除生殖系統(tǒng)能夠增加脂肪儲(chǔ)存并導(dǎo)致體重增加。在線蟲(chóng)中,來(lái)源于生殖系統(tǒng)的信號(hào)能夠調(diào)節(jié)壽命長(zhǎng)短,去除生殖細(xì)胞后會(huì)改變脂肪代謝并且會(huì)顯著延長(zhǎng)壽命。近期在線蟲(chóng)的研究中,提供了許多直接的分子證據(jù)表明生殖、脂肪代謝和壽命是直接相關(guān)的。我們?cè)诰�蟲(chóng)中發(fā)現(xiàn)一個(gè)神奇的基因,c30fl2.4,能夠協(xié)同調(diào)節(jié)生殖過(guò)程、脂肪代謝和壽命。首先我們使用RNA干擾,敲低c30ff2.4后,線蟲(chóng)生殖力下降。通過(guò)CRISPR/Cas9技術(shù)敲除c30f12.4,我們發(fā)現(xiàn)線蟲(chóng)卵子發(fā)生受到干擾,細(xì)線期和偶線期過(guò)渡區(qū)域在線蟲(chóng)生殖腺中消失,導(dǎo)致線蟲(chóng)后代數(shù)目減少。其次,除了生殖力下降外,線蟲(chóng)的壽命也會(huì)受到影響,表現(xiàn)出壽命降低,易衰老。同時(shí),在突變的線蟲(chóng),脂肪代謝也會(huì)發(fā)生變化,脂肪儲(chǔ)存下降,脂肪顆粒變小。為了確定c30f12.4編碼的蛋白的定位,我們構(gòu)建了GFP-C30F12.4融合蛋白的DNA融合序列,并將此序列插入到線蟲(chóng)染色體中,我們發(fā)現(xiàn)GFP-C30F12.4能夠正常表達(dá),并且清晰的定位在生殖細(xì)胞和早期胚胎中。為了確定其分子機(jī)制,我們使用轉(zhuǎn)基因線蟲(chóng)進(jìn)行免疫共沉淀,并且進(jìn)行質(zhì)譜分析,發(fā)現(xiàn)C30F12.4能夠與許多蛋白發(fā)生直接相互作用,C30F12.4可能就是通過(guò)與這些蛋白的相互作用而最終將生殖發(fā)育、脂肪代謝和壽命聯(lián)系在一起的。綜上所示,本文報(bào)道了p-CDK2在減數(shù)分裂性染色體沉默中的重要作用,對(duì)于了解性染色體行為和基因表達(dá)以及性染色體對(duì)于正常的減數(shù)分裂和精子發(fā)生過(guò)程的作用有重要的指導(dǎo)意義；同時(shí)本文報(bào)道了雜交雄性不育小鼠粗線期蛋白譜表達(dá)差異情況,分析了減數(shù)分裂和精子發(fā)生中重要的蛋白之間可能存在的相互關(guān)系,對(duì)于導(dǎo)致雜交雄性不育的基礎(chǔ)的分子機(jī)制探究方面有著重要的作用；最后本文還報(bào)道了蛋白C30F12.4在調(diào)節(jié)線蟲(chóng)生殖發(fā)育、脂肪代謝和壽命中發(fā)揮的重要作用,更深入的了解了生殖、脂肪代謝和壽命之間的相互關(guān)系。
[Abstract]:In the course of meiosis , the X chromosome and Y chromosome of mammals play an important role in the process of meiosis . It is suggested that when two different organisms mate with each other , a sex - specific individual is not able to live or infertility , which must be heterogametic sex . In this study , we found that there may be potential direct interactions between male and female sterile mice . In the study , we found that there may be potential direct interactions between male and female sterile mice . In order to determine the molecular mechanism , we have constructed a DNA fusion sequence of GFP - C30F12 . 4 fusion protein . In order to determine the molecular mechanism , we have constructed the GFP - C30F12 . 4 fusion protein . In order to determine the molecular mechanism , we have constructed the GFP - C30F12 . 4 fusion protein .
At the same time , this paper reports the difference of the expression of the crude protein spectrum of hybrid male sterile mice , analyses the possible interrelations between the meiosis and the important proteins in the spersons , and plays an important role in the research of molecular mechanism which leads to the foundation of hybrid male infertility .
In the end , this paper also reports the important role of protein C30F12 in regulating the reproductive development , fat metabolism and longevity of nematode , and has a deeper understanding of the correlation between reproduction , fat metabolism and life .
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：Q132.1

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本文編號(hào)：1934580