本文選題：減數(shù)分裂 + p-CDK2�。� 參考：《中國科學技術大學》2016年博士論文

【摘要】：隨著工業(yè)化程度的提高、環(huán)境污染的加劇和生活工作壓力的加大,不孕不育正在越來越嚴重的困擾眾多的家庭,并已然成為了人類社會面臨的一個重要問題。值得注意的是,不育癥發(fā)病的概率正在呈現(xiàn)逐年上升趨勢,在適齡人群中估計占15%,并且其中男性方面的因素占到了一半左右。而且在男性不育癥患者中,高達60-75%的患者其發(fā)病機制不明,這就為男性不育的治療帶來了很多的困惑。因此,明確男性不育發(fā)生的原因和分子機制迫在眉睫。精子發(fā)生是一個復雜而又精確的生殖細胞分化的過程,它經(jīng)歷了精原細胞有絲分裂、精母細胞減數(shù)分裂和精子細胞的變形3個關鍵的階段并最終形成了成熟的有功能的精子。減數(shù)分裂Ⅰ期是一個相當特殊的過程,在精子發(fā)生過程中發(fā)揮著重要的作用,減數(shù)分裂進程一旦出錯精子發(fā)生就會停滯并最終導致不育。減數(shù)分裂進程中,同源染色體的配對、聯(lián)會和同源染色體重組是其關鍵事件。在正常的減數(shù)分裂過程中,哺乳動物的X染色體和Y染色體卻只有在部分區(qū)域保持有同源性,只能這個局部區(qū)域配對,而在大部分區(qū)域保持不聯(lián)會,這種不聯(lián)會事件會觸發(fā)性染色體相關基因在減數(shù)分裂粗線期階段表達沉默,也被稱之為減數(shù)分裂性染色體沉默(meiotic sex chromosome inactivation, MSCI), MSCI保證了減數(shù)分裂的順利進行,對于雄性動物生育有著非常重要不可或缺的作用,MSCI的異常會導致精子發(fā)生停滯在粗線期這個階段。CDK2作為重要的細胞周期調控的蛋白激酶,在哺乳動物減數(shù)分裂過程的同源染色體行為中同樣扮演至關重要的角色,特別是在同源染色體的重組和配對以及sex body形成中起關鍵作用。但是就磷酸化CDK2 (p-CDK2)而言,特別是第160位點的蘇氨酸磷酸化的CDK2 (p-CDK239)是否在減數(shù)分裂中的發(fā)揮重要的功能至今未見有相關文獻報道。我們研究發(fā)現(xiàn),p-CDK2能高度特異的定位到未配對的常染色體和sex body,并且能和參與MSCI功能的關鍵蛋白γ-H2AX相互作用,并且這種相互作用是依賴蘇氨酸160磷酸化位點的,定點突變Thr 160會干擾兩蛋白的相互作用,同時我們發(fā)現(xiàn),在CDK2的兩個亞型中,只有亞型1(CDK239)能特異的和γ-H2AX相互作用,并且我們實驗也推斷出只有CDK239定位在sex body。同時我們發(fā)現(xiàn),在下調磷酸化CDK2在sex body的水平后,MSCI異常,性染色體基因活化,提示p-CDK2會參與MSCI�；魻柕し▌t法則指出：當兩種異種生物相互交配時所產(chǎn)生的雜種一代中有某一個性別的個體不能夠成活或不育的話,那一定這兩種生物一定是異配的性別(heterogametic sex)。無論在動物或者植物中,雜交不育都廣泛存在,并且這也是配子結合后生殖隔離的重要機制。在雜交不育小鼠中,通常表現(xiàn)出雄性不育,伴隨有精子發(fā)生異常,導致精子數(shù)目下降或者精子畸形。盡管由精子發(fā)生遭到破壞導致的生殖隔離現(xiàn)象已經(jīng)廣為人知,但是其潛在的遺傳機制和分子基礎依然不得而知。其中一個驅動雜交雄性不育形成的假說被稱之為“減數(shù)分裂驅動力”。在研究中我們發(fā)現(xiàn),當我們使用不同品系的兩種小鼠(PWK/Ph and C57BL/6J)進行交配時,后代的可育性明顯不同。如果將PWK小鼠作為母本,F1代的雄鼠是不育的：如果將C57的小鼠作為母本,Fl代的雄鼠是可育的。并且我們在研究中發(fā)現(xiàn),這個雜交后不育的Fl代雄性小鼠精子發(fā)生會停滯在粗線期精母細胞中期,而且還伴隨著很多的生殖細胞出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象。而且,不育小鼠出現(xiàn)了很多的減數(shù)分裂事件異常現(xiàn)象,如同源染色體聯(lián)會異常、性染色體配對異常、常染色體和性染色體間的行為異常等等。因為減數(shù)分裂過程需要眾多蛋白的參與,所以為了確定造成雜交雄性不育的蛋白分子機制,我們通過密度梯度方法分離出了雜交不育F1和雜交可育F1代的粗線期精母細胞,提取其中的蛋白進行二維電泳檢測兩者之間差異表達的蛋白,來確定這些蛋白是如何協(xié)同調節(jié)雜交不育過程的。分析質譜結果我們發(fā)現(xiàn),在總共4005個檢測到得蛋白中,有215個蛋白表達是上調的,381個蛋白表達是下調的。通過對蛋白質組學的生物信息學分析,我們發(fā)現(xiàn)43個蛋白對減數(shù)分裂過程非常重要,59個蛋白對精子發(fā)生過程至關重要。并且通過生物信息學分析,我們發(fā)現(xiàn)這些蛋白之間可能存在潛在的直接相互作用和相互調節(jié)的關系。通過分析雜交不育小鼠的粗線期細胞蛋白質組,對于我們了解雜交雄性不育和減數(shù)分裂過程有一定的指導意義。生殖、脂肪代謝和壽命是相互聯(lián)系的,眾多研究表明生殖過程能夠影響脂肪代謝和壽命。在許多物種中,剔除生殖系統(tǒng)能夠增加脂肪儲存并導致體重增加。在線蟲中,來源于生殖系統(tǒng)的信號能夠調節(jié)壽命長短,去除生殖細胞后會改變脂肪代謝并且會顯著延長壽命。近期在線蟲的研究中,提供了許多直接的分子證據(jù)表明生殖、脂肪代謝和壽命是直接相關的。我們在線蟲中發(fā)現(xiàn)一個神奇的基因,c30fl2.4,能夠協(xié)同調節(jié)生殖過程、脂肪代謝和壽命。首先我們使用RNA干擾,敲低c30ff2.4后,線蟲生殖力下降。通過CRISPR/Cas9技術敲除c30f12.4,我們發(fā)現(xiàn)線蟲卵子發(fā)生受到干擾,細線期和偶線期過渡區(qū)域在線蟲生殖腺中消失,導致線蟲后代數(shù)目減少。其次,除了生殖力下降外,線蟲的壽命也會受到影響,表現(xiàn)出壽命降低,易衰老。同時,在突變的線蟲,脂肪代謝也會發(fā)生變化,脂肪儲存下降,脂肪顆粒變小。為了確定c30f12.4編碼的蛋白的定位,我們構建了GFP-C30F12.4融合蛋白的DNA融合序列,并將此序列插入到線蟲染色體中,我們發(fā)現(xiàn)GFP-C30F12.4能夠正常表達,并且清晰的定位在生殖細胞和早期胚胎中。為了確定其分子機制,我們使用轉基因線蟲進行免疫共沉淀,并且進行質譜分析,發(fā)現(xiàn)C30F12.4能夠與許多蛋白發(fā)生直接相互作用,C30F12.4可能就是通過與這些蛋白的相互作用而最終將生殖發(fā)育、脂肪代謝和壽命聯(lián)系在一起的。綜上所示,本文報道了p-CDK2在減數(shù)分裂性染色體沉默中的重要作用,對于了解性染色體行為和基因表達以及性染色體對于正常的減數(shù)分裂和精子發(fā)生過程的作用有重要的指導意義；同時本文報道了雜交雄性不育小鼠粗線期蛋白譜表達差異情況,分析了減數(shù)分裂和精子發(fā)生中重要的蛋白之間可能存在的相互關系,對于導致雜交雄性不育的基礎的分子機制探究方面有著重要的作用；最后本文還報道了蛋白C30F12.4在調節(jié)線蟲生殖發(fā)育、脂肪代謝和壽命中發(fā)揮的重要作用,更深入的了解了生殖、脂肪代謝和壽命之間的相互關系。
[Abstract]:In the course of meiosis , the X chromosome and Y chromosome of mammals play an important role in the process of meiosis . It is suggested that when two different organisms mate with each other , a sex - specific individual is not able to live or infertility , which must be heterogametic sex . In this study , we found that there may be potential direct interactions between male and female sterile mice . In the study , we found that there may be potential direct interactions between male and female sterile mice . In order to determine the molecular mechanism , we have constructed a DNA fusion sequence of GFP - C30F12 . 4 fusion protein . In order to determine the molecular mechanism , we have constructed the GFP - C30F12 . 4 fusion protein . In order to determine the molecular mechanism , we have constructed the GFP - C30F12 . 4 fusion protein .
At the same time , this paper reports the difference of the expression of the crude protein spectrum of hybrid male sterile mice , analyses the possible interrelations between the meiosis and the important proteins in the spersons , and plays an important role in the research of molecular mechanism which leads to the foundation of hybrid male infertility .
In the end , this paper also reports the important role of protein C30F12 in regulating the reproductive development , fat metabolism and longevity of nematode , and has a deeper understanding of the correlation between reproduction , fat metabolism and life .
【學位授予單位】：中國科學技術大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：Q132.1

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本文編號：1934580