本文選題：枯草芽孢桿菌 + 分泌��； 參考：《中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院》2016年博士后論文

【摘要】：枯草芽孢桿菌是能形成芽孢的革蘭氏陽性芽孢屬的模式菌株,是工業(yè)、食品、醫(yī)用和飼用重組蛋白的生產(chǎn)優(yōu)秀的宿主表達(dá)系統(tǒng)之一。本論文主要是研究了飼用酶制劑在枯草芽孢桿菌中的分泌表達(dá)和分泌機制,并構(gòu)建了一套蛋白質(zhì)量控制體系的系列敲除菌株,高效的分泌重組蛋白。本論文的實驗內(nèi)容主要分為三部分：實驗一,利用基因工程的方法優(yōu)化了蛋白分泌信號系統(tǒng),建立了一套針對特定目的蛋白CBP21的信號多肽篩選體系,獲得了與特定的目的蛋白CBP21表達(dá)匹配的信號肽,實現(xiàn)目的蛋白的優(yōu)化表達(dá)。結(jié)果顯示：YlqB對CBP21的引導(dǎo)分泌能力最優(yōu)。實驗二,研究了淬滅酶在枯草桿菌中的分泌表達(dá)和其分泌機制。結(jié)果表明AI06BS在沒有信號肽的引導(dǎo)下能分泌到胞外。AI06BS在自溶基因lytC和lytD突變和雙突變工程菌株中以及自溶抗性工程菌株LM2531的表達(dá)分析,表明AIO6BS不是由于細(xì)胞的溶解釋放到胞外的。另外,實驗表明AIO6BS在Sec途徑、Tat途徑和ABC transporter途徑的突變菌的表達(dá)模式和野生型菌株中的沒有明顯的變化。這些結(jié)果表明,AIO6BS可能是通過非傳統(tǒng)的分泌途徑分泌到胞外的。我們對AIO6BS蛋白的cys267進行了飽和突變,分析了所有可能的氨基酸替換對AI06BS的蛋白質(zhì)的分泌表達(dá)影響。位點cys267飽和突變結(jié)果表明,位點cys267對淬滅酶的合成與分泌是非常重要的氨基酸。另外,我們把AIO6BS的同源蛋白、非同源蛋白和分泌伴侶融合在其C端。這些結(jié)果表明融合蛋白沒有輸出到胞外,可能AIO6BS不能作為信號來引導(dǎo)其他重組蛋白的跨膜運輸。實驗三,建了一套高效的分泌重組蛋白的蛋白質(zhì)量控制體系的系列敲除菌株為重組蛋白的表達(dá)提高提供了一套工具。影響重組蛋白分泌的瓶頸之一就是所謂的質(zhì)量控制體系中的蛋白酶。對于枯草芽孢桿菌的胞外蛋白酶、細(xì)胞膜和細(xì)胞壁蛋白酶有詳盡的研究,但是對枯草芽孢桿菌的胞內(nèi)的蛋白質(zhì)量控制系統(tǒng)研究的較少,尤其是關(guān)于胞內(nèi)蛋白酶都重組蛋白的分泌表達(dá)的影響較少。本研究基于同源重組的原理方法,構(gòu)建了胞內(nèi)蛋白酶的系列敲除株。我們用非傳統(tǒng)分泌蛋白AIOBS和Sec途徑分泌的CBP21作為報告基因,分別分析了胞內(nèi)蛋白酶敲除菌株對兩種不同類型的重組蛋白的分泌表達(dá)影響。與野生型菌株相比較,CBP21在BSΔYlbL和BSΔMlpA菌株沒有分泌表達(dá),而在其他的突變株的表達(dá)量都有不同程度的增加。AIO6BS在BSΔAlbF菌株不能分泌表達(dá),而在其他的突變株的表達(dá)量都有不同程度的增加。
[Abstract]:Bacillus subtilis (Bacillus subtilis) is a model strain of Gram-positive spore forming spores. It is one of the excellent host expression systems for the production of recombinant proteins in industry, food, medicine and feed. In this paper, the secretory expression and secretory mechanism of feed enzyme in Bacillus subtilis were studied, and a series of knockout strains with protein quantity control system were constructed to secrete recombinant protein efficiently. The main contents of this thesis are divided into three parts: experiment 1. The protein secretion signal system was optimized by genetic engineering method, and a signal peptide screening system for specific target protein CBP21 was established. The signal peptide matched with the specific target protein CBP21 expression was obtained, and the optimal expression of the target protein was realized. The results showed that: YlqB had the best ability to guide and secrete CBP21. In experiment 2, the secretory expression and mechanism of quenching enzyme in Bacillus subtilis were studied. The results showed that AI06BS could be secreted into extracellular. AI06BS under the guidance of no signal peptide. The expression analysis of AIO6BS in lytC and lytD mutation and double mutant engineering strains and LM2531 showed that AIO6BS was not released to extracellular cells due to cell dissolution. In addition, the expression pattern of AIO6BS in mutants of Sec pathway tat pathway and ABC transporter pathway and wild-type strain were not significantly changed. These results suggest that AIO 6 BS may be secreted to extracellular via unconventional secretory pathways. The saturation mutation of cys267 of AIO6BS protein was carried out, and the effect of all possible amino acid substitutions on the secretion of AI06BS protein was analyzed. The results of cys267 saturation mutation showed that site cys267 was an important amino acid in the synthesis and secretion of quenched enzymes. In addition, we fused the homologous protein, non-homologous protein and secretory chaperone of AIO6BS at its C terminal. These results suggest that the fusion protein is not exported to the extracellular and AIO6BS may not act as a signal to guide the transmembrane transport of other recombinant proteins. In the third experiment, a series of knockout strains with high efficiency for secreting recombinant proteins were established, which provided a tool for improving the expression of recombinant proteins. One of the bottlenecks affecting the secretion of recombinant proteins is the protease in the quality control system. The extracellular protease, cell membrane and cell wall protease of Bacillus subtilis have been studied in detail, but the protein quantity control system of Bacillus subtilis is less studied. In particular, the secretion and expression of recombinant proteins of intracellular protease have little effect. Based on the principle of homologous recombination, a series of knockout strains of intracellular protease were constructed. We used CBP21 secreted by non-traditional secretory protein AIOBS and Sec as reporter genes to analyze the effects of intracellular protease knockout strains on the secretion and expression of two different types of recombinant proteins. Compared with wild-type strains, CBP21 was not secreted in BS 螖 YlbL and BS 螖 MlpA, while in other mutants, the expression of AIO6BS could not be secreted in BS 螖 AlbF. However, the expression of other mutants increased in varying degrees.
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士后
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：Q78;S816

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本文編號：1919019