本文選題：日本三角渦蟲 + 再生��； 參考：《河南師范大學》2016年博士論文

【摘要】：日本三角渦蟲(Dugesia japonica)隸屬扁形動物門(Platyhelminthes),渦蟲綱(Turbellaria),在動物系統(tǒng)演化中占有重要地位,并且渦蟲具有極強的再生能力。目前,雖然已克隆大量與渦蟲再生相關的基因,但其再生機制及相關基因的功能仍不清楚。本文利用RACE技術、Real-time PCR技術、整體原位雜交技術、免疫熒光技術以及RNA干擾技術對日本三角渦蟲神經營養(yǎng)因子信號通路(Neurotrophin signaling pathway)關鍵基因Djras、Djshc、Djakt、Djmek1、Djmek2的cDNA全長進行擴增,并對五基因以及Djflotillins基因進行時空表達模式和功能分析,結果如下:(1)首次克隆了日本三角渦蟲Djras基因的cDNA全長,共1219 bp,最大開放閱讀框(ORF)為555 bp,編碼一個由184個氨基酸殘基組成的蛋白質,該蛋白包含鳥苷酸結合域、GAP作用位點和GEF作用位點三個保守的基序以及一個Caa X模塊;進化分析表明Ras蛋白在不同的物種間高度保守,DjRas蛋白在進化上較其他扁形動物更為原始。Real-time PCR結果表明:Djras基因在渦蟲切割去頭后呈上調表達趨勢,特別是在再生1、7天顯著上調;整體原位雜交結果顯示:Djras基因在渦蟲頭部腦神經節(jié)周圍及腸支表達,在再生芽基部位強烈表達;干擾Djras基因后延緩渦蟲頭再生,并顯著抑制渦蟲正常尾再生。以上結果表明Djras基因在渦蟲再生過程中起著關鍵調控作用。(2)首次克隆了Djshc基因的cDNA全長,共1728 bp,最大開放閱讀框(ORF)為750 bp,編碼一個由249個氨基酸殘基組成的蛋白質,該蛋白質包含PTB和SH2結構域;進化分析表明Shc蛋白質在不同的物種間相對保守,扁形動物門的shc基因在進化上較原始。Real-time PCR結果表明:Djshc基因在渦蟲切割去頭后第1、7天呈上調表達趨勢;整體原位雜交結果顯示:Djshc基因在整體渦蟲身體兩側及腸支部位表達,在再生渦蟲芽基部位強烈表達;RNA干擾結果表明:Djshc基因干擾后部分渦蟲頭再生尾受到抑制,并且整體渦蟲以及再生頭都均出現多眼點畸形。以上結果表明:Djshc基因能夠調控眼點正常分化且參與渦蟲再生。(3)首次克隆了日本三角渦蟲Djakt基因的cDNA全長,共2067 bp,最大開放閱讀框(ORF)為1758 bp,編碼一個由585個氨基酸殘基組成的蛋白質,該蛋白質包含三個保守結構域;進化分析表明Akt蛋白在不同的物種間高度保守,akt基因在扁形動物中具有同一起源。Real-time PCR結果表明:Djakt基因在渦蟲切割去頭后1天顯著上調表達;整體原位雜交結果顯示:Djakt基因在渦蟲再生前期的芽基部位以及再生后期的芽基基部強烈表達;干擾Djakt基因后抑制渦蟲頭再生尾。以上結果表明Djakt基因參與渦蟲再生及身體重塑。(4)首次克隆了日本三角渦蟲Djmek1/2基因的cDNA全長,其中Djmek1基因的cDNA全長共1721 bp,最大開放閱讀框(ORF)為1419 bp,編碼一個由472個氨基酸殘基組成的蛋白質;Djmek2基因的cDNA全長共1743 bp,最大開放閱讀框(ORF)為1278 bp,編碼一個由425個氨基酸殘基組成的蛋白質;兩蛋白都包含一個絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶催化域以及一個保守的Ser-X-Ala-X-Ser基序;進化分析表明Dj Mek1和DjMek2氨基酸序列的同源性為48%,Dj Mek2較Dj Mek1蛋白保守性更高;兩基因的Real-time PCR結果表明:Djmek1基因在渦蟲切割去頭后第1天呈顯著上調表達,第5天下調表達;Djmek2基因在渦蟲切割去頭后第1、7天呈上調表達趨勢;整體原位雜交結果表明:兩基因表達部位相似,都在渦蟲的腸支和再生芽基部位表達;RNA干擾結果顯示:單獨干擾任何一個基因渦蟲沒有顯著形態(tài)變化,兩基因同時干擾后出現再生速度慢、歪尾及尾缺刻等畸形。以上研究結果表明:兩基因在日本三角渦蟲中具有相似的功能且具有互補性,在渦蟲再生過程中起著重要作用。(5)Djflotillins基因整體原位雜交結果表明:兩基因在整體渦蟲中除中樞神經系統(tǒng)和咽部外廣泛表達,在再生渦蟲的芽基部位表達;RNA干擾結果表明:Djflotillin-1干擾后整體渦蟲出現耳突收縮,頭部鈍圓等畸形,且抑制再生或再生速度變慢;Djflotillin-2干擾后整體渦蟲無顯著變化,但是在尾再生頭過程中再生速度減慢;同時干擾兩基因后其結果與Djflotillin-1干擾后相似;兩基因干擾后都出現胞吐及運動速度顯著變慢現象。免疫熒光結果表明:兩基因干擾后中樞神經系統(tǒng)再生正常。以上結果表明:1)Djflotillins基因與渦蟲再生相關,但并沒有參與渦蟲中樞神經系統(tǒng)的功能維持與再生;2)Djflotillins基因可能通過調節(jié)肌動蛋白細胞骨架促進渦蟲的運動;3)Djflotillins基因與渦蟲吞噬作用相關。
[Abstract]:In this paper , the full - length cDNA of Djras gene was amplified by RACE technique , Real - time PCR technique , integral in situ hybridization technique , immunofluorescence technique and RNA interference technique . ( 3 ) The full length of the cDNA of the Djakt gene was cloned , the maximum open reading frame ( ORF ) was 1758 bp , and a protein composed of 585 amino acid residues was encoded . The results showed that : 1 ) The Djflotillins gene was related to the regeneration of the worm , but did not participate in the function maintenance and regeneration of the central nervous system .
【學位授予單位】：河南師范大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：Q78
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本文編號：1900164