本文關(guān)鍵詞：Notch信號通路在骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性DC生成中的作用及分子機制的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院》 2015年

Notch信號通路在骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性DC生成中的作用及分子機制的研究

任少達(dá)  

【摘要】：研究背景間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells, MSCs),目前已經(jīng)在骨髓、臍帶、脂肪等多種組織器官中分離得到。MSCs除具備干細(xì)胞的基本特性外,還具有低免疫原性、免疫調(diào)節(jié)能力等特性,因而引起了再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的廣泛關(guān)注。MSCs發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)能力的可能機制主要是通過分泌具有抑炎作用的可溶性因子或通過細(xì)胞-細(xì)胞間的直接接觸來發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。樹突狀細(xì)胞(dendritic cell, DC)由造血干細(xì)胞(hematopoietic stem cells, HSCs)發(fā)育分化而來,在先天性免疫和獲得性免疫中均有重要作用,而最近發(fā)現(xiàn)的調(diào)節(jié)性DC具有較強的免疫調(diào)節(jié)能力,在免疫系統(tǒng)中作用顯著。因此我們研究MSCs誘導(dǎo)HSCs生成具有調(diào)節(jié)作用的DC,不僅具有重要的理論意義,還為MSCs用于臨床細(xì)胞治療提供了理論依據(jù)。本課題前期研究發(fā)現(xiàn)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(mouse embryonic fibroblast, MEF)來源的MSCs在無外源添加因子的情況下可通過分泌可溶性因子影響調(diào)節(jié)性DC的生成。那么,骨髓來源的MSC在無外源添加因子時是否也可以誘導(dǎo)生成調(diào)節(jié)性DC還有待進(jìn)一步的研究。我們發(fā)現(xiàn),小鼠骨髓來源的MSCs (bone marrow MSCs, BM-MSCs)高表達(dá)Notch配體,那么Notch信號通路能否影響共培養(yǎng)體系中調(diào)節(jié)性DC的生成值得進(jìn)一步深入研究。本論文致力于研究Notch通路在調(diào)節(jié)性DC生成過程中的作用及其詳細(xì)的分子機制。研究目的 基于上述研究現(xiàn)狀和提示,我們系統(tǒng)地研究了BM-MSCs誘導(dǎo)HSCs生成調(diào)節(jié)性DC的詳細(xì)分子機制。1.研究BM-MSCs誘導(dǎo)生成調(diào)節(jié)性DC的免疫表型、轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)情況和因子分泌情況。2.研究這種調(diào)節(jié)性DC在體內(nèi)外的免疫調(diào)節(jié)功能及對結(jié)腸炎模型(Inflammatory bowel disease, IBD)的治療作用。3.研究Notch通路在BM-MSCs誘導(dǎo)生成調(diào)節(jié)性DC過程中的作用及其詳細(xì)分子機制。研究方法1.利用磁珠分選純化獲得BM-MSCs,運用ELISA、qRT-PCR和流式細(xì)胞術(shù)研究其生物學(xué)特性。2.在體外BM-MSCs與HSCs共培養(yǎng)誘導(dǎo)生成一種DC,命名為sBM-DCs,經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測sBM-DCs的表型,Western blot和qRTPCR分別在蛋白和mRNA水平上檢測轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)情況,ELISA檢測細(xì)胞因子分泌情況。3.利用混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)和遲發(fā)型超敏反應(yīng)(Delayed hypersensitivity, DTH)實驗驗證其在體內(nèi)外的免疫調(diào)節(jié)能力,并用流式細(xì)胞術(shù)研究對T細(xì)胞活化標(biāo)志的影響。4.通過HE染色、ELISA研究sBM-DCs對IBD模型的治療作用,并用流式細(xì)胞術(shù)研究sBM-DCs發(fā)揮作用的機制。5.在共培養(yǎng)體系中加入Notch通路抑制劑DAPT,通過流式細(xì)胞術(shù)、Western blot、ELISA研究細(xì)胞生物學(xué)特性的變化,并通過混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)實驗研究其免疫調(diào)節(jié)能力的變化。6.采用siRNA干擾技術(shù)敲低BM-MSCs的Notch配體后,之后再與HSCs共培養(yǎng),研究生成細(xì)胞與sBM-DCs的差異。7.利用病毒感染、Chip和Co-IP實驗研究Notch通路起作用的詳細(xì)機制。8.利用Chip實驗研究表觀遺傳調(diào)控在sBM-DCs生成過程的影響。研究結(jié)果我們首先發(fā)現(xiàn),在無外源細(xì)胞因子的情況下,BM-MSCs與HSCs共培養(yǎng)誘導(dǎo)生成一種新型調(diào)節(jié)性sBM-DCs:該細(xì)胞高表達(dá)CDllb,低表達(dá)CDllc、 CD40. CD80、CD86、Ia; PU.1、Ikaros、RBP-J中度表達(dá),IRF4、IRF8、Batf3、 SpiB、TCF4低表達(dá),Relb、TRAF6、c-Maf、MafB不表達(dá)；同時還發(fā)現(xiàn)具有較強的吞噬能力,可分泌較高水平的IL-10。sBM-DCs在體內(nèi)外具有較強的免疫調(diào)節(jié)能力：在體外,sBM-DCs可以抑制同種淋巴細(xì)胞增殖,抑制T細(xì)胞活化標(biāo)志CD44和CD69的表達(dá)；在體內(nèi),sBM-DCs可以明顯減輕DTH反應(yīng),還對IBD小鼠的腸炎具有一定的治療作用。進(jìn)一步研究結(jié)果表明,此治療作用可能與增加抑炎因子IL-10的分泌、降低炎癥因子IL-2和TNF-a的分泌及增加CD4+CD8+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的比例有關(guān)。Notch通路在sBM-DCs生成過程中發(fā)揮著重要作用,加入Notch通路抑制劑DAPT和干擾BM-MSCs的Notch配體Jagged1阻斷Notch通路后,所生成細(xì)胞變化結(jié)果類似：CDllb顯著降低,CD40、CD80、CD86和Ia有不同程度地升高；Ikaros和RBP-J表達(dá)水平降低,IRF8、TCF4和TRAF6呈不同程度地升高；分泌的IL-10降低、IL-12升高；免疫調(diào)節(jié)能力基本喪失。進(jìn)一步研究結(jié)果表明,Notch通路通過RBP-J和表觀遺傳調(diào)控抑制IRF8的表達(dá)進(jìn)而抑制炎癥因子的分泌對sBM-DCs生成必不可少：干擾IRF8的表達(dá)后,IL-12的mRNA和蛋白水平表達(dá)均降低,IRF8可通過與IL-12的啟動子直接結(jié)合來調(diào)控IL-12的表達(dá)；干擾RBP-J的表達(dá)后,IRF8的mRNA和蛋白水平表達(dá)均下調(diào),表明IRF8和RBP-J的表達(dá)存在密切關(guān)聯(lián),再加入DAPT并不能升高IRF8的表達(dá),進(jìn)一步說明Notch通路通過RBP-J控制IRF8的表達(dá)；在sBM-DCs生成過程中,RBP-J處于去乙�；癄顟B(tài)抑制IRF8的表達(dá),加入DAPT后,RBP-J處于乙�；癄顟B(tài),上調(diào)IRF8的表達(dá)；Notch通路還可以改變IRF8基因的組蛋白修飾狀態(tài),控制其表達(dá)水平。結(jié)論1.在無外源添加因子的情況下,BM-MSCs誘導(dǎo)HSCs生成一種新型sBM-DCs,具有較低免疫原性、較強的吞噬能力；表達(dá)PU.1、Ikaros、RBP-J,低表達(dá)IRF4、IRF8、Batf3、SpiB、TCF4,不表達(dá)Relb、TRAF6、c-Maf、MafB;還可以分泌較高IL-10。2. sBM-DCs在體內(nèi)外具有免疫調(diào)節(jié)能力。3. Notch通路在sBM-DCs生成過程中起著重要作用,可通過RBP-J和表觀遺傳調(diào)控抑制IRF8的表達(dá)來抑制而抑制sBM-DC分泌炎癥因子

【關(guān)鍵詞】：
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R329.2
【目錄】：

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3 劉強;Notch信號通路在骨形態(tài)發(fā)生蛋白9誘導(dǎo)的多潛能干細(xì)胞成骨分化中的作用初步研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2011年

4 趙琳;葉酸對體外缺氧新生大鼠神經(jīng)干細(xì)胞Notch信號通路作用的研究[D];天津醫(yī)科大學(xué);2010年

5 柳柯;Notch信號通路在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向肝細(xì)胞分化過程中的表達(dá)特征[D];南方醫(yī)科大學(xué);2013年

6 劉洪翠;Notch信號通路對小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞功能的調(diào)控作用[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2011年

7 張葉華;補陽還五湯對腦缺血后伴抑郁大鼠腦內(nèi)Notch信號通路的影響[D];湖南中醫(yī)藥大學(xué);2014年

8 吳曉峰;Notch信號通路與生長相關(guān)蛋白-43在內(nèi)側(cè)顳葉癲癇中的作用研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2013年

9 楊云霞;葉酸對局灶性腦梗塞大鼠腦組織Notch信號通路作用的研究[D];天津醫(yī)科大學(xué);2009年

10 白鶴;冠心病氣虛血瘀證小鼠模型Notch信號通路的變化及參參康心膠囊的干預(yù)作用研究[D];甘肅中醫(yī)學(xué)院;2014年

  本文關(guān)鍵詞：Notch信號通路在骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性DC生成中的作用及分子機制的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：185375