本文選題：新中東呼吸綜合征冠狀病毒 + 受體結(jié)合區(qū)　； 參考：《中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院》2017年博士論文

【摘要】：新中東呼吸綜合癥(MERS)冠狀病毒(MERS-CoV)于2012年在沙特地區(qū)首次發(fā)現(xiàn),隨后,在全世界范圍內(nèi)傳播,嚴重威脅人類健康。MERS病毒感染已經(jīng)在27個國家地區(qū)出現(xiàn),感染及死亡病例持續(xù)增加。截止2017年3月8日,世界衛(wèi)生組織報告的感染病例死亡病例分別為1917例和677例,病死率高于35%。針對MERS-CoV疫苗研究已廣泛開展,目前,多種候選疫苗處于臨床前研究階段,尚無人用MERS疫苗上市。以MERS-CoV刺突糖蛋白(Spike protein,S)受體結(jié)合區(qū)(Receptor Binding Domain,RBD)為抗原靶點的亞單位疫苗研究不斷深入,為MERS-CoV蛋白關(guān)鍵免疫保護功能區(qū)。前期研究中,針對免疫有效功能區(qū)段的優(yōu)化,免疫方案確定及免疫保護特性等方面進行了深入的研究。但對于MERS-CoV RBD疫苗的免疫機制研究,仍存在一些問題需解答,例如,自2012年首次發(fā)現(xiàn)以來,經(jīng)歷5年的流行及傳播,毒株出現(xiàn)多種突變,MERS-CoV RBD區(qū)段的突變是否會引起免疫保護能力下降,而導(dǎo)致該區(qū)段不再適合作為疫苗研究靶點?是否可以通過模擬MERS-CoV RBD蛋白的天然構(gòu)象形式,設(shè)計MERS-CoV RBD構(gòu)象優(yōu)化疫苗,提高免疫保護效果?MERS-CoV RBD區(qū)所含免疫功能表位在其誘導(dǎo)免疫保護應(yīng)答中的作用如何,可否對其進行精確評價?可否通過結(jié)構(gòu)優(yōu)化,對MERS-CoV RBD非中和免疫優(yōu)勢表位進行封閉,促進中和性免疫應(yīng)答反應(yīng),使其對MERS-CoV產(chǎn)生完全免疫保護?為了回答以上問題,我們設(shè)計了以下實驗,對MERS-CoV RBD蛋白進行了深入研究,進一步多角度闡明其免疫保護機制。1.MERS-CoV蛋白受體結(jié)合功能區(qū)誘導(dǎo)的免疫保護作用特征研究依據(jù)2012-2015年間,所有不同地區(qū),不同宿主來源的MERS-CoV流行株MERS-CoV RBD區(qū)突變情況,利用定點突變的方法,在EMC-RBD基礎(chǔ)上,構(gòu)建5種RBD疫苗株:2012-RBD,2013-RBD,2014-RBD,2015-RBD及Camel-RBD,分別包含2012-2015年度,人源及駱駝源流行代表病毒株RBD區(qū)單個或多個突變位點,同時構(gòu)建表達MERS病毒S蛋白基因的真核載體,用于包裝17株2012-2015年代表性的人源及駱駝來源的MERS-CoV假病毒,以及5株單克隆抗體逃逸假病毒株。利用真核蛋白表達系統(tǒng),成功在293T細胞中,表達該5種MERS-CoV RBD蛋白,并成功包裝22株高滴度MERS-CoV假病毒,用于免疫血清交叉中和效果評價。利用免疫共沉淀法,酶聯(lián)免疫吸附法和細胞流式法鑒定RBD蛋白與MERS-CoV受體DPP4的結(jié)合能力,結(jié)果表明,MERS-CoV RBD突變蛋白能夠有效地結(jié)合人源及駱駝來源的DPP4蛋白,且前者強于后者;利用酶聯(lián)免疫吸附法測定MERS-CoV RBD蛋白與4種中和性單克隆抗體(鼠源單抗:Mersmab1,人源單抗:m336,m337和m338)的結(jié)合,結(jié)果與EMC-RBD蛋白無顯著差異,具有良好的抗原性;MERS-CoV RBD蛋白免疫小鼠血清,能夠誘導(dǎo)高水平特異性抗體產(chǎn)生,且對17株2012-2015年代表性的人源及駱駝來源的MERS假病毒,5株單克隆抗體逃逸假病毒株,及2株活病毒具有強的交中和反應(yīng)。同時設(shè)計2種包含MERS-CoV受體結(jié)合域(RBM)關(guān)鍵氨基酸位點的RBD蛋白:RBD-FGG和RBD-FGGAA,其功能性,抗原性及所誘導(dǎo)的交叉性中和抗體均有顯著減弱,然而,這種免疫逃逸是在MERS-CoV毒力及傳播流行能力下降甚至消失的情況下發(fā)生,自然情況下,該流行株不能存在,進一步證實了RBD作為亞單位疫苗靶點的可行性。因此,本部分研究證明MERS-CoV RBD作為重要的亞單位疫苗靶點能夠誘導(dǎo)高效廣譜的交叉保護性免疫,對人及駱駝來源的MERS-CoV流行株有交叉中和作用,為研發(fā)安全高效廣譜RBD疫苗提供重要的理論基礎(chǔ)。2.類天然構(gòu)象性三聚體MERS-CoV RBD重組蛋白免疫保護作用研究基于第一部分研究結(jié)果,位于S蛋白內(nèi)的RBD區(qū)可作為廣譜疫苗研究的有效靶點,如何在此基礎(chǔ)上提高免疫保護效果,闡明構(gòu)象性蛋白免疫保護功能區(qū)設(shè)計機制,成為下一個研究重點。MERS-CoV S蛋白在病毒表面形成天然三聚體結(jié)構(gòu),本部分研究擬對RBD蛋白進行構(gòu)象性優(yōu)化與設(shè)計,通過重組融合三聚體形成單位,即Foldon序列,重組表達MERS-CoV RBD-Fd蛋白。以期通過形成三聚體蛋白,模擬病毒表面RBD蛋白天然構(gòu)象,繼而被開發(fā)成既能發(fā)揮免疫保護功能的疫苗候選蛋白,又能有效阻斷病毒感染的治療性蛋白藥物。結(jié)果表明:首先,成功在真核系統(tǒng)表達出具有三聚體構(gòu)象的MERS-CoV RBD-Fd蛋白,且能夠與MERS病毒受體DPP4高效結(jié)合,能夠有效阻斷MERS假病毒感染MERS病毒敏感細胞系。其次,動物免疫及血清學(xué)檢驗表明,RBD-Fd蛋白能夠有效誘導(dǎo)高滴度的中和抗體的產(chǎn)生,且能夠維持長期保護性免疫應(yīng)答反應(yīng)。對人DPP4轉(zhuǎn)基因小鼠的活病毒攻毒試驗產(chǎn)生良好的保護效果。本部分研究重點強調(diào)在以包膜糖蛋白為靶點的亞單位疫苗設(shè)計中天然構(gòu)象性抗原的作用,證明了基于免疫原天然構(gòu)象的疫苗設(shè)計應(yīng)用于MERS-CoV RBD亞單位疫苗的可行性。為研發(fā)RBD為基礎(chǔ)的MERS預(yù)防及治療性藥物奠定基礎(chǔ)。3.MERS-CoV病毒RBD關(guān)鍵位點糖基化修飾對免疫保護作用影響和機制研究本部分研究通過闡明特定表位在MERS-CoV RBD蛋白在誘導(dǎo)機體產(chǎn)生中和保護免疫所發(fā)揮的作用,鑒定非中和表位及免疫優(yōu)勢表位,進一步揭示MERS-CoV RBD疫苗免疫保護機制并指導(dǎo)MERS-CoV RBD疫苗及其他病毒性亞單位疫苗的優(yōu)化設(shè)計�；诘谝徊糠趾偷诙糠盅芯拷Y(jié)果,證實RBD存在特定表位的改變所引發(fā)的免疫應(yīng)答發(fā)生變化,而基于結(jié)構(gòu)構(gòu)象的疫苗設(shè)計可以應(yīng)用于RBD蛋白分子。根據(jù)MERS-CoV RBD蛋白晶體結(jié)構(gòu)及功能特點,選取4個在MERS-CoV RBD不同的獨立表位:Arg511、Ala562、Val403和Thr579。利用定點突變PCR方法在相應(yīng)位點形成N糖基化基序,在哺乳動物細胞293T中,分別表達并純化4種突變MERS-CoV RBD蛋白。利用SDS-PAGE和質(zhì)譜分析的方法鑒定了糖基化的形成。利用AlphaScreen法和流式細胞法分析重組MERS-CoV RBD蛋白與人DPP4蛋白間的結(jié)合能力結(jié)果顯示,位于511位置的糖基化修飾可阻斷RBD蛋白與受體DPP4的結(jié)合。位于562位置的糖基化修飾可降低MERS-CoV RBD蛋白與受體DPP4的結(jié)合。而位于403和579位的糖基化則對RBD與DPP4之間的結(jié)合沒有影響。實驗也分析了糖基化位點的引入對MERS-CoV RBD蛋白抗原性變化(hMS-1,m336-Fab,m337-Fab和m338-Fab)。ELISA結(jié)果顯示,位于511位的糖基化突變完全阻斷了RBD蛋白與Mersmab1的結(jié)合,降低了MERS-CoV RBD蛋白對m336-Fab和m337-Fab的結(jié)合。與511位不同,403,562和579位糖基化對MERS-CoV RBD蛋白與任意4種中和性單克隆抗體結(jié)合均無顯著影響。免疫原性及中和抗體分析顯示,與MERS-CoV RBD野生型蛋白相比,分別帶有579和511位糖基化表位的MERS-CoV RBD蛋白,前者能夠顯著提高中和抗體滴度,而后者的中和抗體滴度則顯著降低。而分別帶有403和562位點糖基化的MERS-CoV RBD蛋白所誘導(dǎo)的中和抗體滴度與野生型相比則沒有顯著性差別,同時,在活病毒保護性評價中,得到相似結(jié)果。為定量地評價表位的中和免疫原性,我們提出一個新的“中和免疫原性指數(shù)”(NII)的概念,并定義其為,在某特定表位中,糖基化探針的出現(xiàn)或消失對免疫原誘導(dǎo)中和免疫效應(yīng)能力的改變的比值。NII可以作為一個有效的評價手段定量地評價MERS-CoV RBD疫苗上特定表位,進一步闡明免疫保護機制,從而指導(dǎo)MERS-CoV RBD疫苗的優(yōu)化設(shè)計�？傊�,我們的研究在鑒定了MERS-CoV RBD蛋白誘導(dǎo)廣譜交叉性中和保護效果的基礎(chǔ)上,通過對RBD分子構(gòu)象性改造,及結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)的RBD分子修飾提高RBD亞單位疫苗的保護效果,對以結(jié)構(gòu)蛋白為靶點的抗病毒疫苗優(yōu)化設(shè)計提供重要評價方法,進一步揭示了MERS-CoV關(guān)鍵免疫保護功能區(qū)的免疫保護作用機制。
[Abstract]:The MERS - CoV RBD has been extensively studied in 27 countries . In this study , we have conducted an in - depth study on the immune mechanism of MERS - CoV RBD . The results showed that MERS - CoV RBD can induce high - level specific antibody production . The results showed that MERS - CoV RBD protein could induce high - level specific antibody production . The results showed that MERS - CoV RBD was used as important subunit vaccine target to induce high - level specific antibody production , and it was proved that MERS - CoV RBD was used as important subunit vaccine target to induce high - level specific antibody production . Based on the results of the first part and the second part , it is proved that the RBD - FBD protein can effectively induce the generation of high titer neutralizing antibody and can effectively block the immune response reaction of MERS - CoV RBD . The results of ELISA showed that the glycosylation mutation at 511 site completely blocked the binding of RBD protein to Mersmab1 , and reduced the binding of MERS - CoV RBD protein to m336 - Fab and m337 - Fab .

【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R392

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本文編號：1813005