本文選題：LSD1 + 組蛋白去甲基化　； 參考：《吉林大學》2016年博士論文

【摘要】：背景:LSD1是第一個被發(fā)現(xiàn)的組蛋白賴氨酸特異性去甲基化酶,它的發(fā)現(xiàn)使人們重新定義了組蛋白去甲基化這一可逆的過程,它以一種FAD依賴性的氧化反應方式特異性的催化H3K4位點的單甲基化及二甲基化的去甲基化,且可以和TAL1等多種轉(zhuǎn)錄因子以復合體形式對靶基因的表達發(fā)揮調(diào)控功能,在造血系統(tǒng)分化過程中發(fā)揮重要作用。包括GATA1、GATA2多種轉(zhuǎn)錄因子所形成的調(diào)控網(wǎng)絡對于維持正常的造血細胞分化起到了至關重要的作用,GATA2主要表達于造血干/祖細胞,并隨造血細胞分化表達下調(diào),而GATA1表達含量上調(diào),進而調(diào)控造血細胞的增殖和分化(GATA Switch),GATA1、GATA2這種表達含量的動態(tài)變化趨勢對于造血系統(tǒng)分化具有重要意義,目前對于GATA Switch機制的研究主要集中于GATA1、GATA2互相的調(diào)控功能。目的:從表觀遺傳角度出發(fā),探究組蛋白甲基化在造血分化過程中的影響,從表觀遺傳修飾層面上對調(diào)控造血細胞分化的機制作進一步闡釋。GATA1、GATA2以自身蛋白表達量動態(tài)變化呈現(xiàn)的GATA Switch更是具有深遠的研究意義。因LSD1介導的表觀遺傳修飾作用可以調(diào)節(jié)多種造血相關靶基因的轉(zhuǎn)錄水平,研究LSD1對GATA Switch的調(diào)控機制成了探討表觀遺傳修飾作用調(diào)控造血系統(tǒng)分化的重要著力點。選取人的紅系白血病細胞K562、小鼠的紅系白血病細胞MEL為細胞模型,通過誘導細胞向紅細胞方向分化,動態(tài)完整地分析在造血細胞分化不同時期LSD1所介導的表觀遺傳修飾作用對GATA Switch的影響,從組蛋白修飾這一全新的角度闡釋GATA Switch的調(diào)控機制,為我們進一步探索造血系統(tǒng)分化過程中的調(diào)控機制提供理論依據(jù)及新的研究方向,為闡明疾病中表觀遺傳修飾變化以及基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的分子機制奠定基礎。方法:通過免疫共沉淀IP實驗鑒定了和GATA2發(fā)生相互作用的LSD1復合體,比較了在造血細胞分化的不同時期,LSD1、TAL1、GATA2之間的相互作用水平的變化情況;構建、表達并純化了具有不同結(jié)構域的GST-LSD1N-term、GST-LSD1N-term+SWIRM、GST-LSD1SWIRM、GST-LSD1AO、GST-LSD1SWIRM+AO融合蛋白,通過GST-pull down Assay,具化了LSD1和GATA2之間相互作用的結(jié)構域;通過RT-PCR檢測了缺失LSD1對GATA轉(zhuǎn)錄因子表達水平的影響;通過染色質(zhì)免疫共沉淀Ch IP等技術揭示了LSD1復合體在造血分化的不同時期作用于不同的GATA基因位點,分析了造血分化過程中GATA1、GATA2基因位點組蛋白甲基化水平的變化,探討了LSD1所介導的組蛋白去甲基化功能對于靶基因表達水平、造血細胞分化帶來的影響。結(jié)果:通過GST-pull down Assay、免疫共沉淀IP、染色質(zhì)免疫共沉淀Ch IP等技術揭示了GATA2可以和LSD1復合體相互作用,LSD1通過SWIRM結(jié)構域與GATA2相互作用。造血分化早期GATA2募集LSD1至GATA1基因db G、IE位點,進而抑制GATA1表達;隨造血細胞分化,GATA2和LSD1之間相互結(jié)合變?nèi)?TAL1和LSD1之間結(jié)合水平增強,TAL1將LSD1招募至GATA2基因的1S啟動子位點,進而抑制GATA2表達,促進紅細胞分化。LSD1通過調(diào)節(jié)GATA1、GATA2蛋白表達情況對造血系統(tǒng)分化發(fā)揮重要調(diào)控功能,LSD1、TAL1、GATA2以復合體形式動態(tài)調(diào)控這一過程。結(jié)論:從一個全新的組蛋白修飾的角度闡釋了GATA Switch的調(diào)控機制,明確了LSD1所介導的表觀遺傳學修飾對GATA Switch的調(diào)控功能,從而建立了LSD1調(diào)控造血分化機制的新模型。
[Abstract]:Background: LSD1 is the first found histone lysine specific demethylation enzyme. Its discovery makes people redefine the reversible process of histone demethylation, which catalyzes the monomethylation of H3K4 loci and demethylation of the two methylation with a FAD dependent oxidation reaction, and can be more than TAL1 and so on. The transcription factor plays an important role in the expression of the target gene in the form of complex, which plays an important role in the differentiation of hematopoietic system. The regulatory network, including GATA1, GATA2, plays a vital role in maintaining normal hematopoietic cell differentiation, and GATA2 is mainly expressed in hematopoietic stem / progenitor cells. The expression of hematopoietic cells is down regulated and the expression of GATA1 is up-regulated, and then the proliferation and differentiation of hematopoietic cells (GATA Switch), and the dynamic trend of GATA1 and GATA2 expression content is important for the differentiation of hematopoietic system. At present, the research on GATA Switch mechanism mainly focuses on GATA1 and GATA2 mutual regulation function. From the epigenetic point of view, the effect of histone methylation on the process of hematopoietic differentiation is explored..GATA1 is further interpreted from the epigenetic modification level to regulate the differentiation of hematopoietic cells. The GATA Switch presented by GATA2 in the dynamic changes of its own protein expression is of profound significance. The apparent remains of LSD1 The effect of modification can regulate the transcriptional level of a variety of hematopoietic target genes. The study of the regulatory mechanism of LSD1 on GATA Switch has become an important point to explore the effect of epigenetic modification on the regulation of hematopoietic differentiation. The human erythroleukemia cell K562 is selected and the erythroleukemia cell MEL in mice is the cell model, and the cells are induced to be red. The cell direction differentiation, dynamic and complete analysis of the effect of epigenetic modification on GATA Switch mediated by LSD1 in different stages of hematopoietic differentiation, explains the regulatory mechanism of GATA Switch from the new angle of histone modification, and provides a theoretical basis for us to further explore the regulation mechanism in the process of hematopoietic system differentiation. The research direction is the basis for elucidating the changes in epigenetic modification and the molecular mechanism of gene transcription regulation in the disease. Methods: the LSD1 complex interacting with GATA2 was identified by the immunoprecipitation IP experiment. The changes in the level of interaction between LSD1, TAL1 and GATA2 at different stages of the differentiation of hematopoietic cells were compared. Construction, expression and purification of GST-LSD1N-term, GST-LSD1N-term+SWIRM, GST-LSD1SWIRM, GST-LSD1AO, GST-LSD1SWIRM+AO fusion protein with different domains, through GST-pull down Assay, with the interaction between LSD1 and GATA2; through RT-PCR detection of the effect of missing LSD1 on the expression level of transcription factors; The technique of chromatin immunoprecipitation Ch IP revealed that the LSD1 complex acted on different GATA loci in different periods of hematopoiesis differentiation, and analyzed the changes in the methylation level of the GATA1, GATA2 gene loci during the hematopoietic differentiation, and discussed the expression level of the target gene and the hematopoiesis mediated by the histone demethylation function mediated by LSD1. The effect of cell differentiation. Results: GST-pull down Assay, immunoprecipitation IP, chromatin immunoprecipitation Ch IP and other techniques reveal that GATA2 can interact with LSD1 complex, LSD1 interacts with GATA2 by SWIRM domain. With the differentiation of hematopoietic cells, the combination of GATA2 and LSD1 weakens and the binding level between TAL1 and LSD1 is enhanced. TAL1 recruits LSD1 to the 1S promoter site of the GATA2 gene, and then inhibits GATA2 expression, and promotes the proliferation of erythrocyte differentiation.LSD1 by regulating GATA1, and GATA2 protein expression plays an important role in the differentiation of the blood making system. This process is dynamically regulated by the complex form. Conclusion: the regulatory mechanism of GATA Switch is explained from a new histone modification point of view, and the regulatory function of epigenetic modification mediated by LSD1 is clarified, and a new model for the regulation of hematopoietic differentiation by LSD1 is established.

【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：Q75

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本文編號：1779603