本文選題：LSD1 + 組蛋白去甲基化　； 參考：《吉林大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：背景:LSD1是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的組蛋白賴(lài)氨酸特異性去甲基化酶,它的發(fā)現(xiàn)使人們重新定義了組蛋白去甲基化這一可逆的過(guò)程,它以一種FAD依賴(lài)性的氧化反應(yīng)方式特異性的催化H3K4位點(diǎn)的單甲基化及二甲基化的去甲基化,且可以和TAL1等多種轉(zhuǎn)錄因子以復(fù)合體形式對(duì)靶基因的表達(dá)發(fā)揮調(diào)控功能,在造血系統(tǒng)分化過(guò)程中發(fā)揮重要作用。包括GATA1、GATA2多種轉(zhuǎn)錄因子所形成的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)對(duì)于維持正常的造血細(xì)胞分化起到了至關(guān)重要的作用,GATA2主要表達(dá)于造血干/祖細(xì)胞,并隨造血細(xì)胞分化表達(dá)下調(diào),而GATA1表達(dá)含量上調(diào),進(jìn)而調(diào)控造血細(xì)胞的增殖和分化(GATA Switch),GATA1、GATA2這種表達(dá)含量的動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)對(duì)于造血系統(tǒng)分化具有重要意義,目前對(duì)于GATA Switch機(jī)制的研究主要集中于GATA1、GATA2互相的調(diào)控功能。目的:從表觀遺傳角度出發(fā),探究組蛋白甲基化在造血分化過(guò)程中的影響,從表觀遺傳修飾層面上對(duì)調(diào)控造血細(xì)胞分化的機(jī)制作進(jìn)一步闡釋。GATA1、GATA2以自身蛋白表達(dá)量動(dòng)態(tài)變化呈現(xiàn)的GATA Switch更是具有深遠(yuǎn)的研究意義。因LSD1介導(dǎo)的表觀遺傳修飾作用可以調(diào)節(jié)多種造血相關(guān)靶基因的轉(zhuǎn)錄水平,研究LSD1對(duì)GATA Switch的調(diào)控機(jī)制成了探討表觀遺傳修飾作用調(diào)控造血系統(tǒng)分化的重要著力點(diǎn)。選取人的紅系白血病細(xì)胞K562、小鼠的紅系白血病細(xì)胞MEL為細(xì)胞模型,通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞向紅細(xì)胞方向分化,動(dòng)態(tài)完整地分析在造血細(xì)胞分化不同時(shí)期LSD1所介導(dǎo)的表觀遺傳修飾作用對(duì)GATA Switch的影響,從組蛋白修飾這一全新的角度闡釋GATA Switch的調(diào)控機(jī)制,為我們進(jìn)一步探索造血系統(tǒng)分化過(guò)程中的調(diào)控機(jī)制提供理論依據(jù)及新的研究方向,為闡明疾病中表觀遺傳修飾變化以及基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。方法:通過(guò)免疫共沉淀IP實(shí)驗(yàn)鑒定了和GATA2發(fā)生相互作用的LSD1復(fù)合體,比較了在造血細(xì)胞分化的不同時(shí)期,LSD1、TAL1、GATA2之間的相互作用水平的變化情況;構(gòu)建、表達(dá)并純化了具有不同結(jié)構(gòu)域的GST-LSD1N-term、GST-LSD1N-term+SWIRM、GST-LSD1SWIRM、GST-LSD1AO、GST-LSD1SWIRM+AO融合蛋白,通過(guò)GST-pull down Assay,具化了LSD1和GATA2之間相互作用的結(jié)構(gòu)域;通過(guò)RT-PCR檢測(cè)了缺失LSD1對(duì)GATA轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)水平的影響;通過(guò)染色質(zhì)免疫共沉淀Ch IP等技術(shù)揭示了LSD1復(fù)合體在造血分化的不同時(shí)期作用于不同的GATA基因位點(diǎn),分析了造血分化過(guò)程中GATA1、GATA2基因位點(diǎn)組蛋白甲基化水平的變化,探討了LSD1所介導(dǎo)的組蛋白去甲基化功能對(duì)于靶基因表達(dá)水平、造血細(xì)胞分化帶來(lái)的影響。結(jié)果:通過(guò)GST-pull down Assay、免疫共沉淀IP、染色質(zhì)免疫共沉淀Ch IP等技術(shù)揭示了GATA2可以和LSD1復(fù)合體相互作用,LSD1通過(guò)SWIRM結(jié)構(gòu)域與GATA2相互作用。造血分化早期GATA2募集LSD1至GATA1基因db G、IE位點(diǎn),進(jìn)而抑制GATA1表達(dá);隨造血細(xì)胞分化,GATA2和LSD1之間相互結(jié)合變?nèi)?TAL1和LSD1之間結(jié)合水平增強(qiáng),TAL1將LSD1招募至GATA2基因的1S啟動(dòng)子位點(diǎn),進(jìn)而抑制GATA2表達(dá),促進(jìn)紅細(xì)胞分化。LSD1通過(guò)調(diào)節(jié)GATA1、GATA2蛋白表達(dá)情況對(duì)造血系統(tǒng)分化發(fā)揮重要調(diào)控功能,LSD1、TAL1、GATA2以復(fù)合體形式動(dòng)態(tài)調(diào)控這一過(guò)程。結(jié)論:從一個(gè)全新的組蛋白修飾的角度闡釋了GATA Switch的調(diào)控機(jī)制,明確了LSD1所介導(dǎo)的表觀遺傳學(xué)修飾對(duì)GATA Switch的調(diào)控功能,從而建立了LSD1調(diào)控造血分化機(jī)制的新模型。
[Abstract]:Background: LSD1 is the first found histone lysine specific demethylation enzyme. Its discovery makes people redefine the reversible process of histone demethylation, which catalyzes the monomethylation of H3K4 loci and demethylation of the two methylation with a FAD dependent oxidation reaction, and can be more than TAL1 and so on. The transcription factor plays an important role in the expression of the target gene in the form of complex, which plays an important role in the differentiation of hematopoietic system. The regulatory network, including GATA1, GATA2, plays a vital role in maintaining normal hematopoietic cell differentiation, and GATA2 is mainly expressed in hematopoietic stem / progenitor cells. The expression of hematopoietic cells is down regulated and the expression of GATA1 is up-regulated, and then the proliferation and differentiation of hematopoietic cells (GATA Switch), and the dynamic trend of GATA1 and GATA2 expression content is important for the differentiation of hematopoietic system. At present, the research on GATA Switch mechanism mainly focuses on GATA1 and GATA2 mutual regulation function. From the epigenetic point of view, the effect of histone methylation on the process of hematopoietic differentiation is explored..GATA1 is further interpreted from the epigenetic modification level to regulate the differentiation of hematopoietic cells. The GATA Switch presented by GATA2 in the dynamic changes of its own protein expression is of profound significance. The apparent remains of LSD1 The effect of modification can regulate the transcriptional level of a variety of hematopoietic target genes. The study of the regulatory mechanism of LSD1 on GATA Switch has become an important point to explore the effect of epigenetic modification on the regulation of hematopoietic differentiation. The human erythroleukemia cell K562 is selected and the erythroleukemia cell MEL in mice is the cell model, and the cells are induced to be red. The cell direction differentiation, dynamic and complete analysis of the effect of epigenetic modification on GATA Switch mediated by LSD1 in different stages of hematopoietic differentiation, explains the regulatory mechanism of GATA Switch from the new angle of histone modification, and provides a theoretical basis for us to further explore the regulation mechanism in the process of hematopoietic system differentiation. The research direction is the basis for elucidating the changes in epigenetic modification and the molecular mechanism of gene transcription regulation in the disease. Methods: the LSD1 complex interacting with GATA2 was identified by the immunoprecipitation IP experiment. The changes in the level of interaction between LSD1, TAL1 and GATA2 at different stages of the differentiation of hematopoietic cells were compared. Construction, expression and purification of GST-LSD1N-term, GST-LSD1N-term+SWIRM, GST-LSD1SWIRM, GST-LSD1AO, GST-LSD1SWIRM+AO fusion protein with different domains, through GST-pull down Assay, with the interaction between LSD1 and GATA2; through RT-PCR detection of the effect of missing LSD1 on the expression level of transcription factors; The technique of chromatin immunoprecipitation Ch IP revealed that the LSD1 complex acted on different GATA loci in different periods of hematopoiesis differentiation, and analyzed the changes in the methylation level of the GATA1, GATA2 gene loci during the hematopoietic differentiation, and discussed the expression level of the target gene and the hematopoiesis mediated by the histone demethylation function mediated by LSD1. The effect of cell differentiation. Results: GST-pull down Assay, immunoprecipitation IP, chromatin immunoprecipitation Ch IP and other techniques reveal that GATA2 can interact with LSD1 complex, LSD1 interacts with GATA2 by SWIRM domain. With the differentiation of hematopoietic cells, the combination of GATA2 and LSD1 weakens and the binding level between TAL1 and LSD1 is enhanced. TAL1 recruits LSD1 to the 1S promoter site of the GATA2 gene, and then inhibits GATA2 expression, and promotes the proliferation of erythrocyte differentiation.LSD1 by regulating GATA1, and GATA2 protein expression plays an important role in the differentiation of the blood making system. This process is dynamically regulated by the complex form. Conclusion: the regulatory mechanism of GATA Switch is explained from a new histone modification point of view, and the regulatory function of epigenetic modification mediated by LSD1 is clarified, and a new model for the regulation of hematopoietic differentiation by LSD1 is established.

【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：Q75

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本文編號(hào)：1779603