本文選題：胸膜肺炎放線桿菌 + RNA-seq技術(shù)　； 參考：《華中農(nóng)業(yè)大學》2016年博士論文

【摘要】：豬傳染性胸膜肺炎(porcine contagious pleuropneumonia,PCP)是一種具有高度接觸性的豬呼吸道傳染病,給全世界養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。其病原胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacilluspleuropneumoniae,APP)是巴斯德菌科放線桿菌屬的一種革蘭氏陰性小桿菌。APP基因組序列的注釋工作是通過基于基因預測、計算機算法等生物信息學方法來實現(xiàn)的。由于計算機方法在原核生物基因注釋方面固有的局限性,目前對APP基因組的注釋遠未完成。應用高通量RNA-seq技術(shù)進行細菌轉(zhuǎn)錄組分析,能夠準確有效的發(fā)現(xiàn)基因表達區(qū)和未知的轉(zhuǎn)錄單位,尤其能夠用于sRNA、UTR和調(diào)節(jié)功能元件的鑒定。蛋白質(zhì)作為生命活動的主要執(zhí)行者和功能載體,通過蛋白質(zhì)相互作用行使復雜的生物功能,參與了生物體內(nèi)幾乎所有的生物過程。研究蛋白質(zhì)的相互作用有助于理解生物體尤其是致病菌各項生命活動的機理,并能為抗菌藥物提供新的靶標。目前,APP蛋白質(zhì)相互作用的數(shù)據(jù)非常匱乏,這極大的限制了對APP的基因功能、調(diào)控機理、致病機制和藥靶篩選等研究。本研究一方面采用RNA-seq技術(shù)對APP進行了全面的轉(zhuǎn)錄組分析,對現(xiàn)有的基因組注釋進行了完善,并對APP的基因結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)單元進行了詳細的分析鑒定。另一方面,采用同源映射的方法構(gòu)建了APP蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡,并挖掘了未知蛋白的功能,揭示了新的蛋白質(zhì)相互作用,從蛋白組水平分析了APP的信號調(diào)控機制,預測了潛在藥物靶標。取得的主要研究結(jié)果如下:1.APP單堿基分辨率轉(zhuǎn)錄圖譜的構(gòu)建與分析通過對RNA-seq獲得的reads的質(zhì)量評估與APP基因組匹配并統(tǒng)計分析,匹配到基因組的reads數(shù)為38,568,297,reads的長度為90bp,得到的總堿基數(shù)為3,723,758,460,得到樣品的測序數(shù)據(jù)大小為3.5Gb,相當于基因組覆蓋深度的1700倍,表明本研究所獲得的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)具有較高的質(zhì)量和分辨率,能夠很好地反應APP基因組的轉(zhuǎn)錄狀況,并能對低豐度的轉(zhuǎn)錄本進行鑒定,進而成功繪制了APP全基因組水平的單堿基分辨率轉(zhuǎn)錄圖譜。鑒定出APP基因組注釋2147個基因中共有1933個基因是轉(zhuǎn)錄的,并對其表達量進行了標準化的RPKM計算。對轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物對應的蛋白質(zhì)進行了cog分析,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄的基因分布在所有的cog功能分類中。同時鑒定出2325個轉(zhuǎn)錄的基因間區(qū)區(qū)域。依據(jù)rna-seq數(shù)據(jù),對原有的app基因組注釋進行了優(yōu)化。在app中共鑒定出32個新基因,最短的編碼26個氨基酸,最長的編碼90個氨基酸,平均大小約為47個氨基酸。通過轉(zhuǎn)錄圖譜對現(xiàn)有基因組注釋的35個基因的起始位置進行了矯正。通過rna-seq數(shù)據(jù)共預測出1946個utr。其中847個utr位于app操縱子內(nèi)部,無法明顯區(qū)分utr的邊界。其余1099個utr位于app操縱子外部。對找到的具有5’-utr和3’-utr相應的基因進行cog功能分析,并分析了不同cog功能分類基因的utr長度分布�？梢园l(fā)現(xiàn)信號轉(zhuǎn)導相關(guān)基因的utr最長,而dna復制、重組、修復,翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)錄相關(guān)基因的utr較短。篩選出app中的51個候選srna,通過將鑒定出的所有候選srna序列,比對rfam數(shù)據(jù)庫,鑒定出11個在其他物種中保守的、有明確注釋功能的srna。鑒定出由840個共表達基因?qū)?共1230個基因)組成的351個獨立的操縱子,并通過rt-pcr對其中隨機選取的26個操縱子的40對共表達基因?qū)M行了驗證。上述研究結(jié)果不僅證實了app注釋基因的轉(zhuǎn)錄情況,對原基因組注釋進行了矯正,使得當前的基因組注釋更加完善準確,并且發(fā)現(xiàn)了較多新的功能元件(例如新的蛋白,非編碼srna,操縱子結(jié)構(gòu)),為該病原菌基因功能、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)機理和致病機制的研究奠定了基礎。2.app蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡的構(gòu)建與分析基于同源蛋白映射的方法,利用app基因組全部的蛋白質(zhì)編碼信息,以及從數(shù)據(jù)庫下載的蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù),構(gòu)建了app蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡。互作網(wǎng)絡共包括2737對非冗余蛋白質(zhì)互作對,共涉及553個蛋白質(zhì)。所包含的蛋白分布在所有的cog功能分類中,極顯著富集的cog功能類為j類(翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)、生物合成)、e類(氨基酸的運輸與代謝)和s類(功能未知的蛋白質(zhì))。利用cytoscape軟件對app蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡的拓撲結(jié)構(gòu)與屬性進行分析,發(fā)現(xiàn)app蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡具有小世界性和無尺度網(wǎng)絡的性質(zhì),這樣的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡具有良好的容錯性和穩(wěn)定性,而且信息傳遞速度快,可以對外界壓力變化迅速作出響應,能夠在環(huán)境突發(fā)壓力下展現(xiàn)出較高的耐受力。構(gòu)建了hns蛋白質(zhì)的互作子網(wǎng)絡,并對其包含的所有16對蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系通過細菌雙雜交的方法進行實驗驗證,證實本研究構(gòu)建的網(wǎng)絡的可靠性。通過APP蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡中與假設蛋白存在互作關(guān)系的功能已知的蛋白質(zhì)對23個假設蛋白進行了蛋白質(zhì)功能預測。APP蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡中有131個蛋白質(zhì)存在于KEGG通路數(shù)據(jù)庫中全部32條生物通路中,生物通路中復雜的蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系使得APP生物途徑中的少數(shù)蛋白質(zhì),當在外界壓力下表達受到抑制,生物途徑并不會終止,而是可以通過其他替代蛋白質(zhì)行使功能繼續(xù)完成該生物途徑。進一步構(gòu)建由胞壁合成與嘧啶代謝通路相關(guān)的蛋白質(zhì)互作子網(wǎng)絡,進行APP中藥物靶標的預測。從全局角度結(jié)合蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫和參考文獻,確定已知藥物靶標22個,有文獻報道的潛在藥物靶標13個,新的候選藥物靶標18個。對信號傳導類蛋白互作網(wǎng)絡也做了進一步分析。APP全基因組中,參與機體信號傳導的蛋白共有38個,在本研究所構(gòu)建的APP蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡中參與信號傳導的蛋白共有15個,相互作用的比例為39.5%。構(gòu)建了信號轉(zhuǎn)導類蛋白質(zhì)互作子網(wǎng)絡,并對信號轉(zhuǎn)導類蛋白和轉(zhuǎn)錄類蛋白通過相互作用所參與的信號轉(zhuǎn)導途徑進行了分析,發(fā)現(xiàn)APP中存在T類信號傳導蛋白和K類轉(zhuǎn)錄因子蛋白的相互作用,例如Crp蛋白與RpoA、RpoD和PurR蛋白互作,共同調(diào)控下游基因的表達。說明APP中存在復雜的信號傳導和基因調(diào)控模式。這些研究結(jié)果預測了新的APP蛋白質(zhì)功能,從蛋白組水平初步揭示了APP的代謝網(wǎng)絡和信號傳導模式,為APP基因功能、信號交流與基因調(diào)控、環(huán)境適應與致病機理的研究提供了豐富的數(shù)據(jù)基礎。
[Abstract]:On the one hand , the genetic function , regulation mechanism , pathogenic mechanism and target screening of APP have been analyzed by using high - throughput RNA - seq technology .

【學位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S852.61
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本文編號：1771748