本文關(guān)鍵詞：高效家蠶絲腺生物反應(yīng)器的關(guān)鍵因素分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《浙江大學(xué)》 2015年

高效家蠶絲腺生物反應(yīng)器的關(guān)鍵因素分析

葉露鵬  

【摘要】：家蠶是鱗翅目昆蟲的典型代表,作為第二大模式昆蟲,它不僅有著重要的研究價值,而且可以帶來可觀的經(jīng)濟價值。轉(zhuǎn)基因技術(shù)的成功建立是生命科學(xué)領(lǐng)域的里程碑,它頻繁的被用于改變生物的性狀以及通過這種技術(shù)在生物體中表達一些珍貴的外源蛋白。PiggyBac轉(zhuǎn)座子是最具吸引力的轉(zhuǎn)座原件之一,它已經(jīng)廣泛的被應(yīng)用于十多種生物的研究。PiggyBac轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)為家蠶的轉(zhuǎn)基因研究提供了堅實的基礎(chǔ)。家蠶絲腺有著驚人的蛋白合成和分泌的能力,是一種非常理想的生物反應(yīng)器。經(jīng)過數(shù)十年的努力,研究人員已經(jīng)創(chuàng)建了家蠶中部和后部絲腺生物反應(yīng)器。這些生物反應(yīng)器已經(jīng)成功表達了數(shù)十種外源蛋白。然而,現(xiàn)有的家蠶絲腺生物反應(yīng)器效率依舊不高,主要體現(xiàn)在piggyBac轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因效率低、外源蛋白表達量較低、以及理想的轉(zhuǎn)基因陽性個體篩選較復(fù)雜等等,這幾個問題成為了建立高效家蠶絲腺生物反應(yīng)器所面臨的最大障礙。因此,提高轉(zhuǎn)基因效率、提高外源基因表達量以及創(chuàng)建一種快速外源基因高效表達的轉(zhuǎn)基因陽性個體篩選方法顯得尤為重要。本文就針對這些科學(xué)問題展開了一系列的研究,取得的主要成果歸納如下：1、類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)蛋白介導(dǎo)piggyBac轉(zhuǎn)座子的高效轉(zhuǎn)座針對piggyBac介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因效率不高這個問題,本研究創(chuàng)建了一種有效提高轉(zhuǎn)座效率的新方法,該方法的核心是構(gòu)建一個類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)蛋白(transcription activator-like effector, TALE)和piggyBac轉(zhuǎn)座酶(PBase)的融合蛋白(TALE-PBase)。實驗證明TALE-PBase融合蛋白可以顯著地將轉(zhuǎn)座效率提高到63.9%,這相當(dāng)于是目前轉(zhuǎn)座效率平均水平的7倍。而且新方法的轉(zhuǎn)基因陽性蛾區(qū)中的陽性個體數(shù)每區(qū)平均達到近18條,比目前家蠶轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灥钠骄阶畲筇岣吡?.7倍。TALE-PBase融合蛋白介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)不僅提高了轉(zhuǎn)基因陽性蛾區(qū)數(shù),而且也明顯提高了陽性蛾區(qū)中的陽性個體數(shù)。這兩方面的提高是piggyBac轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)的巨大突破,為今后的轉(zhuǎn)基因研究提供了很好的技術(shù)支撐。2、家蠶絲膠1啟動子的結(jié)構(gòu)與活性分析啟動子是調(diào)控目的基因時空表達重要的調(diào)控原件之一。然而,絕大多數(shù)的研究將目光放在了核心啟動子或近端啟動子區(qū)域,而近端啟動子5’端的序列常常被人們所忽視。本研究就4kb長度的家蠶絲膠1 (sericin 1, Serl)啟動子序列通過生物信息學(xué)方法預(yù)測到種類眾多的潛在的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點,采用轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灠l(fā)現(xiàn)啟動子序列包含的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點越多且種類越豐富時,啟動子的轉(zhuǎn)錄活性就越強大。但是重復(fù)的近端啟動子多個拷貝組合并不能提高下游基因的轉(zhuǎn)錄水平,而且重復(fù)的近端啟動子拷貝數(shù)越多,下游基因的轉(zhuǎn)錄水平反而越低。結(jié)果說明,4 kb長度的Serl啟動子要比其短的啟動子活性要高,重復(fù)的近端啟動子多個拷貝組合并不能提高下游基因轉(zhuǎn)錄活性。這個結(jié)果為今后構(gòu)建高效家蠶絲腺生物反應(yīng)器時選擇合適長度的啟動子提供了參考。3、PiggyBac轉(zhuǎn)座子在家蠶基因中的定向轉(zhuǎn)座轉(zhuǎn)座子的隨機轉(zhuǎn)座時常不利于外源基因的表達,而且可能會引起內(nèi)源基因的突變。TALE-PBase融合蛋白介導(dǎo)的轉(zhuǎn)座理論上有可能實現(xiàn)定向轉(zhuǎn)座。PBase通過TALE靶向蛋白的牽引到達目的位點,從而在目的位點實現(xiàn)定向轉(zhuǎn)座。通過研究我們發(fā)現(xiàn)了TALE-PBase介導(dǎo)的轉(zhuǎn)座改變了piggyBac轉(zhuǎn)座子原先完全隨機插入的特性,而是變的更加具有傾向性,但還沒有得到真正定向轉(zhuǎn)座的結(jié)果。我們還在71個轉(zhuǎn)座家蠶中發(fā)現(xiàn)了2對插入位點一樣的家蠶,這種現(xiàn)象在常規(guī)的piggyBac轉(zhuǎn)座研究中是非常罕見的。由此可見,TALE對PBase在一定程度上起到了靶向引導(dǎo)作用,這為今后在個體水平實現(xiàn)定點轉(zhuǎn)座提供了寶貴的參考價值。4、TALEN介導(dǎo)的家蠶同源重組家蠶受精卵相當(dāng)于家蠶的早期個體,相比細(xì)胞,它更能反應(yīng)生命的真實情況。因此,用家蠶受精卵進行同源重組(homologous recombination, HR)實驗可以反應(yīng)個體水平同源重組的發(fā)生概率。同源重組精確的基因組編輯能力可以彌補其它基因組打靶技術(shù)的不足,而且也可以解決piggyBac轉(zhuǎn)座子隨機插入基因組這一問題。但同源重組的低效率現(xiàn)象是阻礙其廣泛應(yīng)用的一個限制因素。本研究采用蠶卵為材料,將TALEN mRNA和供體同源重組質(zhì)粒注射到產(chǎn)卵8h的家蠶受精卵內(nèi),經(jīng)72 h后進行TALEN打靶效率的鑒定以及同源重組效率的檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn)TALEN在顯微注射后72 h就已經(jīng)對靶位點產(chǎn)生了明顯突變,在檢測的15組樣品中有12組出現(xiàn)了明顯打靶,打靶效率達到80%。并且在15組受精卵中成功檢測到3組包含陽性的同源重組個體,同源重組效率達到20%。這種蠶卵早期的TALEN打靶效率以及同源重組效率的檢測可以在短期內(nèi)評判實驗的可行性,為后續(xù)陽性同源重組個體的篩選提供保障。同時也證明采用TALEN mRNA和供體同源重組質(zhì)粒組合可以實現(xiàn)精確的基因組編輯。5、外源基因表達效率的輔助檢測雖然piggyBac轉(zhuǎn)座子是以隨機的方式插入基因組,但是將外源基因表達框和標(biāo)志基因表達框以相同轉(zhuǎn)錄方向緊密的構(gòu)建在一起時,我們相信即使在不同的插入位點,兩個表達框受到來自基因組的影響是相近的。我們構(gòu)建了螢火蟲熒光素酶(firefly luciferase, FLuc)和綠色熒光蛋白(green fluorescent protein, EGFP)兩個相鄰的基因,作了轉(zhuǎn)錄水平的相關(guān)分析,結(jié)果表明即使插入位點不同,這兩個基因的轉(zhuǎn)錄水平總是顯著相關(guān)的。ELISA實驗進一步顯示EGFP的轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平同樣也是顯著相關(guān)。所以,外源基因的表達水平可以通過檢測標(biāo)志基因(EGFP)的表達水平來簡單的預(yù)測。綜上所述,本論文從提高轉(zhuǎn)基因效率、提高外源基因的表達效率以及建立外源基因表達效率的輔助檢測方法這3個層次來優(yōu)化家蠶絲腺生物反應(yīng)器并取得了相應(yīng)的成果,為最終建立高效家蠶絲腺生物反應(yīng)器奠定了堅實的基礎(chǔ)。TALEN打靶效率以及同源重組效率的檢測可以在短期內(nèi)評判實驗的可行性,為后續(xù)陽性同源重組個體的篩選提供保障。同時也證明采用TALEN mRNA和供體同源重組質(zhì)粒組合可以實現(xiàn)精確的基因組編輯。

【關(guān)鍵詞】：
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：Q78;S881.2
【目錄】：

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3 周家慶;不同轉(zhuǎn)座子在豬和鼠胎兒成纖維細(xì)胞中轉(zhuǎn)座活性的比較研究[D];揚州大學(xué);2013年

4 謝雨琇;多轉(zhuǎn)座子載體的構(gòu)建及其在哺乳動物細(xì)胞和胚胎中轉(zhuǎn)座活性研究[D];揚州大學(xué);2013年

5 劉玉博;利用轉(zhuǎn)座子插入突變篩選高效產(chǎn)油菌株[D];河南農(nóng)業(yè)大學(xué);2009年

6 張陸;豬源多重耐藥大腸桿菌轉(zhuǎn)座子的流行及其接合共轉(zhuǎn)移分析[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

7 鄧平;深紅紅螺菌高產(chǎn)氫突變株的篩選及轉(zhuǎn)座子插入位點分析[D];西南大學(xué);2008年

8 唐江濤;細(xì)菌轉(zhuǎn)座子Tn5gusA5在野油菜黃單胞菌8004中轉(zhuǎn)座規(guī)律分析及生物學(xué)驗證[D];廣西大學(xué);2003年

9 謝飛;“睡美人”轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)對于外源基因整合和表達促進作用[D];揚州大學(xué);2008年

10 何姍;表達豬端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)座子載體的構(gòu)建及其在豬細(xì)胞永生化中的應(yīng)用[D];揚州大學(xué);2014年

  本文關(guān)鍵詞：高效家蠶絲腺生物反應(yīng)器的關(guān)鍵因素分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：176865