本文選題：牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞 + 分化��； 參考：《東北農(nóng)業(yè)大學(xué)》2015年博士論文

【摘要】：肌肉的生長主要依賴骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖分化,使肌纖維長度增加,周徑增粗。肌細(xì)胞生成素(Myogenin,Myo G)是生肌調(diào)節(jié)因子(myogenic regulatory factors,MRFs)家族的成員之一,是骨骼肌發(fā)育和肌肉再生的關(guān)鍵調(diào)控因子,在骨骼肌細(xì)胞的形成過程中起中心調(diào)控作用。Myo G基因表達(dá)與出生后肌肉再生密切相關(guān)。鑒于Myo G基因在骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞(skeletal muscle-derived satellite cells,MDSCs)分化過程中的重要作用,本研究從轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平探討Myo G基因在牛MDSCs分化過程中的表達(dá)調(diào)控機(jī)制。首先采用高通量深度測序(Hi Seq deep sequencing)技術(shù)進(jìn)行了牛MDSCs分化過程中差異mi RNA和m RNA表達(dá)譜的測定,用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR(q RT-PCR)技術(shù)驗(yàn)證了高通量測序結(jié)果。采用log2-ratio、Scatter plot法分析比較了不同分化階段mi RNA和m RNA表達(dá)量的差異。利用生物學(xué)信息學(xué)方法分析表達(dá)譜結(jié)果中可能靶向作用于Myo G基因的mi RNA和轉(zhuǎn)錄因子,篩選出mi R-2400和轉(zhuǎn)錄因子EGR1為Myo G基因的候選調(diào)控因子。通過雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)、過表達(dá)和抑制、q RT-PCR、Western blot、Ed U、流式細(xì)胞術(shù)等技術(shù),研究了mi R-2400對Myo G基因轉(zhuǎn)錄后水平的表達(dá)調(diào)控作用。運(yùn)用免疫熒光(共聚焦)、cris PRi及慢病毒介導(dǎo)的EGR1過表達(dá)和干擾、q RT-PCR、Western blot、Ch IP等技術(shù)研究了EGR1在轉(zhuǎn)錄水平上對MyoG基因的表達(dá)調(diào)控作用。首次證實(shí)了mi R-2400和轉(zhuǎn)錄因子EGR1可調(diào)控牛MDSCs分化過程中Myo G基因的表達(dá)。研究結(jié)果將有助于進(jìn)一步了解Myo G的分子調(diào)控機(jī)制,有助于深入了解其促進(jìn)肌肉分化的作用機(jī)制,進(jìn)而為提高肉產(chǎn)量、改良家畜遺傳育種提供重要依據(jù)。具體研究結(jié)果如下:1.構(gòu)建了牛MDSCs分化不同階段差異mi RNA表達(dá)譜。在牛MDSCs增殖階段(MDSC-P)、分化24 h(MDSC-D1)和分化72 h(MDSC-D3)三個(gè)不同分化階段的RNA文庫中共鑒定得到564個(gè)保守mi RNAs和53個(gè)候選mi RNAs。與MDSC-P相比,在MDSC-D1中表達(dá)上調(diào)的mi RNA有9個(gè),表達(dá)下調(diào)的mi RNA有165個(gè);在MDSC-D3中表達(dá)上調(diào)mi RNA有15個(gè),表達(dá)下調(diào)的mi RNA有145個(gè)。與MDSC-D1相比,MDSC-D3中表達(dá)上調(diào)的mi RNA有17個(gè),表達(dá)下調(diào)的mi RNA有54個(gè)。利用生物信息學(xué)預(yù)測到65個(gè)靶向作用于牛Myo G基因的mi RNA,這些mi RNA在差異mi RNA表達(dá)譜中表達(dá)變化倍數(shù)大于2的有12個(gè),分別為:bta-mi R-122、bta-mi R-129-3p、bta-mi R-2450a、bta-mi R-331、bta-mi R-2398、bta-mi R-376b、bta-miR-196a、bta-miR-2400、bta-mi R-29a、bta-miR-155、bta-miR-28和bta-mi R-449a,其中miR-2400是牛中特異表達(dá)的mi RNA,因此本研究中選擇mi R-2400作為調(diào)節(jié)Myo G基因表達(dá)的候選mi RNA.2.構(gòu)建了牛MDSCs分化不同階段差異m RNA表達(dá)譜。在MDSC-P、MDSC-D1和MDSC-D3中分別鑒定得到9924、10023和9948個(gè)mRNA。與MDSC-P相比,在MDSC-D1中表達(dá)上調(diào)的m RNA有9924個(gè),表達(dá)下調(diào)的有2125個(gè);在MDSC-D3中表達(dá)上調(diào)的mRNA有2508個(gè),表達(dá)下調(diào)有2381個(gè)。與mdsc-d1相比,在mdsc-d3中表達(dá)上調(diào)的mrna有1243個(gè),表達(dá)下調(diào)的有9948個(gè)。生物信息學(xué)預(yù)測myog基因啟動子上結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子有myod、egr1、mef2、mef3、srf及mef-1,其中,egr1在mdsc-d3的表達(dá)比在mdsc-p中升高了10.49倍,是這些轉(zhuǎn)錄因子中表達(dá)變化最顯著的,因此本研究選擇egr1作為調(diào)節(jié)myog基因表達(dá)的候選轉(zhuǎn)錄因子。3.mir-2400對myog基因表達(dá)調(diào)控:利用qrt-pcr檢測了mir-2400和myogmrna在mdscs分化不同時(shí)期的表達(dá)量,結(jié)果顯示,隨著分化程度的加深,mir-2400的表達(dá)量逐漸降低,而myog的mrna表達(dá)水平卻逐漸升高,說明mir-2400的表達(dá)水平與myog基因表達(dá)水平呈反向趨勢,為典型的mirna-靶基因互作關(guān)系。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)進(jìn)一步證實(shí)mir-2400能夠結(jié)合到myog基因的3′-utr590-597bp處。這暗示著mir-2400能夠負(fù)向調(diào)控myog基因的表達(dá)。通過轉(zhuǎn)染pcdna3.1(+)-mir-2400和mir-2400-i,分別使mir-2400在mdscs過表達(dá)和抑制表達(dá),結(jié)果表明,mir-2400過表達(dá)后牛mdscs內(nèi)源性myog基因的表達(dá)顯著下調(diào);而抑制mir-2400表達(dá)后內(nèi)源性myog基因的表達(dá)上調(diào),這就證明mir-2400能夠負(fù)向調(diào)控myog基因的表達(dá)。通過edu法、pcna免疫熒光、cck-8、流式細(xì)胞術(shù)檢測mir-2400過表達(dá)和抑制表達(dá)后mdscs增殖情況,發(fā)現(xiàn)過表達(dá)mir-2400促進(jìn)牛mdscs增殖,而抑制mir-2400表達(dá)減弱牛mdscs增殖,這進(jìn)一步證實(shí)mir-2400能夠負(fù)向調(diào)控myog基因的表達(dá)。mir-2400是內(nèi)含子mirna,位于牛whsc1l1基因的第8個(gè)內(nèi)含子中。crispri干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明干擾宿主基因whsc1l1轉(zhuǎn)錄后mir-2400表達(dá)也隨著降低,兩者變化規(guī)律一致。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)表明mir-2400無單獨(dú)啟動子,結(jié)合crispri干擾實(shí)驗(yàn),證實(shí)mir-2400是由宿主基因轉(zhuǎn)錄后的內(nèi)含子加工而來,不是作為一個(gè)單獨(dú)的基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄合成。4.egr1對myog基因表達(dá)調(diào)控:qrt-pcr、westernblot和免疫熒光的檢測結(jié)果表明,在mdscs分化過程中egr1基因的表達(dá)早于myog基因,即分化過程中egr1基因先表達(dá)升高,myog基因后表達(dá)升高,最后肌球蛋白重鏈(myosinheavychain,mhc)基因表達(dá)升高。在分化的第4d,egr1基因表達(dá)開始降低,隨后myog基因和mhc基因的表達(dá)也逐漸降低。這說明egr1表達(dá)的變化總是先于myog基因表達(dá)的變化。免疫熒光結(jié)果表明,在細(xì)胞分化時(shí),有部分的egr1轉(zhuǎn)移入細(xì)胞核。這暗示著egr1有調(diào)控myog基因表達(dá)的物質(zhì)基礎(chǔ)。利用crispri和慢病毒介導(dǎo)的egr1干擾分別在轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后水平上干擾egr1的表達(dá),發(fā)現(xiàn)myog基因和mhc基因表達(dá)下降。而過表達(dá)egr1之后,myog基因和mhc基因的表達(dá)則升高。在細(xì)胞水平上,干擾egr1后,g1/g0期細(xì)胞比例降低,g2/m期細(xì)胞比例升高,增殖相關(guān)基因ccnd2和ccnb1表達(dá)升高;過表達(dá)egr1后,細(xì)胞增殖速率顯著降低,g1/g0期細(xì)胞比例升高,s期細(xì)胞比例降低,并且增殖相關(guān)基因ccnd2和ccnb1表達(dá)降低。說明egr1表達(dá)的變化確實(shí)能夠正向引起myog基因表達(dá)的變化。chip實(shí)驗(yàn)和定點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)egr1可結(jié)合到myog基因啟動子區(qū)-211至-217位點(diǎn)。這些結(jié)果證實(shí)egr1可結(jié)合到myog基因啟動子區(qū),參與mdscs分化過程中myog基因的正向表達(dá)調(diào)控。結(jié)論:1.構(gòu)建了牛MDSCs分化不同階段差異mi RNA表達(dá)譜,靶向作用于牛Myo G基因的mi RNA有65個(gè),表達(dá)升高倍數(shù)大于2的有12個(gè),其中mi R-2400是牛中特異表達(dá)的mi RNA。mi R-2400靶向結(jié)合于Myo G基因的3′-UTR 590-597 bp處。過表達(dá)miR-2400下調(diào)Myo G基因的表達(dá),促進(jìn)MDSCs增殖;抑制mi R-2400則上調(diào)Myo G基因表達(dá),減弱MDSCs增殖,可見mi R-2400負(fù)向調(diào)節(jié)Myo G基因的表達(dá)。2.構(gòu)建了牛MDSCs分化不同階段差異mRNA表達(dá)譜,結(jié)果顯示在MDSCs分化過程中轉(zhuǎn)錄因子EGR1的表達(dá)量顯著上調(diào)。在MDSCs分化過程中,EGR1基因先表達(dá)升高,Myo G基因后表達(dá)升高。EGR1可結(jié)合到MyoG基因啟動子區(qū),參與MDSCs分化過程中Myo G基因的正向表達(dá)調(diào)控。
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【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：Q78;Q254

【參考文獻(xiàn)】

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1 王秋華;曹允考;李樹峰;佟慧麗;興孝友;李光鵬;嚴(yán)云勤;;牛MyoG基因啟動子的克隆及功能的初步分析[J];畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào);2012年01期

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本文編號：1756973