發(fā)布時間：2018-04-11 13:52

  本文選題：擬南芥 + 隱花色素　； 參考：《吉林大學》2016年博士論文

【摘要】：擬南芥隱花色素CRYPTOCHROME作為藍光受體,在植物生長和發(fā)育中發(fā)揮著重要作用。擬南芥隱花色素CRY1和CRY2在藍光下會首先經(jīng)歷磷酸化,然后通過藍光依賴的方式與其它蛋白相互作用,將藍光信號傳遞給下游蛋白。這種藍光依賴的磷酸化伴隨藍光信號轉導的起始,與其功能正相關。然而迄今為止,隱花色素CRY藍光依賴磷酸化的分子機制尚不清楚。本實驗室以擬南芥CRY2為誘餌篩選擬南芥c DNA酵母文庫,發(fā)現(xiàn)4個在藍光下能與CRY2特異互作的蛋白激酶,并將其分別命名為PPK1,PPK2,PPK3和PPK4(Photoregulatory Protein Kinase,PPK),該發(fā)現(xiàn)為揭示隱花色素CRY2藍光特異磷酸化的分子機制找到新著手點。通過酵母雙雜交液體顯色實驗和植物體內CRY2互作蛋白質譜檢測發(fā)現(xiàn),PPK1,PPK2,PPK3和PPK4均可以藍光依賴地與CRY2發(fā)生相互作用,表明PPKs可能是一直尋找的CRY2蛋白激酶。人類胚胎腎細胞(HEK293T)中共表達擬南芥CRY2和PPKs發(fā)現(xiàn),藍光下CRY2會在SDS聚丙烯酰胺凝膠上形成遷移變慢的上移條帶,而這種上移條帶會被磷酸酶消化除去,這就表明CRY2與PPKs共表達時會被PPKs磷酸化。同樣條件下,CRY2分別與其它蛋白激酶(CK1.3,CK1.4或是MAPK12)共同表達時,并沒有出現(xiàn)遷移慢的磷酸化條帶,表明PPKs磷酸化CRY2的特異性。HEK293T細胞中CRY2磷酸化動態(tài)分析顯示,與植物中CRY2磷酸化模式一樣,PPKs對CRY2的磷酸化程度依賴于藍光處理時間和強度。質譜分析擬南芥CRY2磷酸化位點實驗中發(fā)現(xiàn),至少18個絲氨酸位點和6個蘇氨酸位點可能會發(fā)生磷酸化,其中7個絲氨酸位點(S506,S523,S525,S526,S598,S599和S605)在三次獨立實驗中均被檢測到,可信度較高。將PPK1,PPK2和PPK3分別與CRY2在HEK293T中共同表達,同樣進行CRY2磷酸化位點質譜檢測分析發(fā)現(xiàn),CRY2仍主要在上述7個絲氨酸位點(S506,S523,S525,S526,S598,S599和S605)發(fā)生磷酸化,與植物體內CRY2磷酸化位點匹配。而CK1.3,CK1.4蛋白激酶和PPK1催化失活突變體PPK1D267N分別與CRY2共表達時,CRY2中并未檢測到明顯的磷酸化位點,綜合這些結果進一步證明PPKs是CRY2特異的蛋白激酶。結合以上實驗結果,隨后分析了植物體內PPKs對CRY2生化活性和生物功能的影響。由于PPK基因功能的冗余性,實驗中主要以ppk123和ppk124三突變體以及多PPK基因干擾株系ami R4K為材料進行分析。與cry2突變體一樣,ppk123,ppk124和ami R4K均表現(xiàn)出長日條件下開花時間延遲且FT m RNA表達顯著下調。重要的是,這三種基因型植株中CRY2磷酸化明顯受到破壞,磷酸化依賴的泛素化降解也同樣受到影響。綜合上述結果,表明植物體中PPKs在藍光下磷酸化CRY2并促進CRY2的生物活性及其藍光依賴的泛素化降解。隱花色素CRY2經(jīng)歷藍光依賴磷酸化后會被快速降解,且該過程通過泛素化-蛋白酶體途徑完成。泛素化介導的蛋白降解過程是一種終止隱花色素介導信號轉導的重要方式,但目前擬南芥CRY2特異的E3連接酶仍未被發(fā)現(xiàn),其泛素化降解的分子機制仍不清晰。本研究主要利用分子遺傳學手段,分析不同基因型突變體中CRY2的穩(wěn)定性,進而解析CRY2藍光依賴泛素化降解的分子機制。曾有文獻指出ZTL和LKP2通過介導藍光信號抑制CRY2信號途徑互作蛋白CIB1的降解。而通過分析ztl-3和ztl/lkp2突變體中CRY2的降解情況發(fā)現(xiàn),CRY2的穩(wěn)定性并未發(fā)生變化,表明ZTL和LKP2并不介導藍光信號參與調節(jié)CRY2的泛素化降解。cul4-1突變體中CRY2的穩(wěn)定性提高,說明COP1/SPA1更可能是作為E3連接酶與CUL4形成復合體影響CRY2的泛素化降解,而不是作為CRY2信號途徑里的互作蛋白產(chǎn)生影響。然而,在cul4-1,cop1-5和spa1234突變體中,CRY2的泛素化降解只是被部分破壞,暗示著存在其它E3泛素連接酶參與調節(jié)CRY2藍光依賴泛素化降解。正如假設,實驗發(fā)現(xiàn)相比于野生型植株cul1突變體中CRY2在藍光下的穩(wěn)定性顯著提高,也就說明CUL1依賴的E3泛素連接酶參與了CRY2的藍光依賴泛素化降解。結合以上實驗結果,我們推斷藍光下CRY2會經(jīng)歷由CUL1依賴的E3泛素連接酶和CUL4依賴的E3泛素連接酶催化的泛素化降解,進一步闡明了CRY2藍光依賴泛素化降解的分子機制。
[Abstract]:In this paper , we found that the phosphorylation of CRY2 and CRY2 on SDS - polyacrylamide gel showed that the phosphorylation of CRY2 and CRY2 in the blue light was dependent on the time and intensity of CRY2 phosphorylation . In this study , the degradation of CRY2 in CRY2 was studied by means of molecular genetics .

【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：Q943.2

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本文編號：1736275