本文選題：大腸桿菌Nissle　切入點：1917　出處：《揚州大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：大腸桿菌Nissle 1917 (Escherichia coli Nissle 1917;EcN)是德國醫(yī)生Alfred Nissle于1917年從一名抗腹瀉士兵糞便中首次分離出的一株益生菌,由于腸道內(nèi)存在該株“強(qiáng)大效能且具有拮抗活性”的大腸桿菌,該士兵免受腸道傳染病流行區(qū)疾病的侵?jǐn)_。隨后,在德國和其他一些歐洲國家,EcN作為人用藥Mutaflor(?)的活性成分,在治療各種腸道疾病中扮演著重要角色。近年來,EcN表達(dá)外源基因作為疾病診治載體的研究越來越多,其內(nèi)含的pMUT2、I型分泌系統(tǒng)以及V型分泌系統(tǒng)等皆用于將外源抗原展呈于EcN表面。鞭毛表面展示屬于細(xì)菌表面展示技術(shù)之一,其基于鞭毛蛋白的高變區(qū)可容納外源多肽且組裝成鞭毛絲進(jìn)而實現(xiàn)外源多肽的表面展示。鞭毛表面展示技術(shù)較多在報道沙門氏菌中,而未曾在EcN菌株中探索研究。鑒于EcN是強(qiáng)大效能益生菌,本研究首先構(gòu)建了EcN無質(zhì)�？寺【闑cNc (EcN cured of its two cryptic plasmids pMUT1 and pMUT2; EcNc),以其鞭毛蛋白高變區(qū)為切入點來探討EcNc鞭毛表面展示。EcN中含有pMUT1、pMUT2兩個隱秘大質(zhì)粒,且2個質(zhì)粒在傳代中很穩(wěn)定,不易丟失；pMUT1帶有ColE1類型復(fù)制系統(tǒng),pMUT2含有類ColE2復(fù)制系統(tǒng),然而對這2個隱秘大質(zhì)粒的生物學(xué)意義了解較少。有研究報道大腸桿菌的致病性受到質(zhì)粒的調(diào)控,且部分大腸桿菌菌株的抗性基因也可能與其隱秘質(zhì)粒有關(guān)。為減少上述隱秘質(zhì)粒對外源性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化和基因組DNA操作帶來的不便,同時考慮EcN作為載體菌時其隱秘質(zhì)粒對人和宿主動物可能產(chǎn)生的副作用,本試驗使用限制性內(nèi)切酶Sph I將攜帶sacB的自殺性質(zhì)粒載體pRE112分別與隱秘質(zhì)粒pMUT1、pMUT2連接,構(gòu)建重組質(zhì)粒載體pMUT1-pRE112和pMUT2-pRE112,進(jìn)一步應(yīng)用競爭性抑制分別去除EcN自身攜帶的隱秘質(zhì)粒,基于自殺性質(zhì)粒sacB基因的特性,在含10%蔗糖的培養(yǎng)基平板上實施自殺質(zhì)粒自身消除,最后獲得EcN無質(zhì)粒克隆菌株即EcN△pMUT1△ApMUT2,命名為EcNc (EcN cured of its twocryptic plasmids pMUT1 and pMUT2)對無質(zhì)粒菌株EcNc生長狀況、生化試驗、電鏡觀察以及體外細(xì)胞黏附檢測,試驗結(jié)果表明去除兩個隱秘大質(zhì)粒后的EcNc,其生長、生化特性、血清學(xué)、形態(tài)學(xué)特征、體外細(xì)胞黏附與原型EcN一致,利用獲得的EcNc菌株,將更加方便質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化和遺傳相關(guān)生物學(xué)操作。基于編碼EcN菌株鞭毛蛋白的fliC基因序列,利用λ噬菌體Red同源重組系統(tǒng)對EcNc菌株的fliC基因進(jìn)行敲除。首先純化回收含有fliC基因同源臂片段和氯霉素抗性基因(cat)表達(dá)盒的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,電轉(zhuǎn)化至已攜帶pKD46質(zhì)粒的EcNc菌株中,在Red同源重組酶Gam、Exo、Beta的作用下,PCR回收片段通過兩翼同源序列與染色體對應(yīng)靶基因序列同源重組,在氯霉素抗性平板上篩選到一次同源重組菌株EcNc △fliC::cat。再將質(zhì)粒pCP20電轉(zhuǎn)化EcNc △fliC::cat菌株,通過其在42℃C表達(dá)的Flp重組酶消除PCR片段中FRT位點之間的氯霉素抗性基因。經(jīng)過PCR鑒定和DNA測序證明二次重組菌,即fliC缺失菌株EcNc △fliC構(gòu)建成功。將pBR322-fliC電轉(zhuǎn)化EcNc △fliC構(gòu)建了回補菌株EcNc △fliC/pBR322-fliC。同時,以構(gòu)建好的pU18-fliC重組質(zhì)粒為模板,通過反向PCR分別構(gòu)建了鞭毛蛋白基因859-888位、829-858位缺失的片段fliC1、fliC2,雙酶切后連接到自殺載體pRE112中,構(gòu)建重組自殺載體pRE 112-fliC1、pRE112-fliC2,將其分別導(dǎo)入EcNc菌株中,通過一次重組、二次重組及DNA測序篩選到EcNc鞭毛蛋白基因部分高變區(qū)缺失的菌株EcNcfliC1、EcNcfliC2。上述EcNc、EcNc △fliC、EcNc △fliC/pBR322-fliC、EcNc fliC1、EcNc fliC2的成功構(gòu)建,旨在進(jìn)一步探索鞭毛蛋白高變區(qū)序列改變對EcNc性狀的影響。測試EcNc、EcNc △fliC、EcNc △fliC/pBR322-fliC、EcNc fliC1、EcNcfliC2的生長性能、運動性、鞭毛的抗原性、鞭毛形成以及體外細(xì)胞黏附、體內(nèi)腸道定植能力。結(jié)果顯示,各株細(xì)菌生化特性一致,生長性能沒有差異變化；EcNc △fliC在半固體培養(yǎng)基上無運動性能,Western blot檢測不到鞭毛蛋白的表達(dá),且電鏡下觀察不到鞭毛形態(tài),其對IPEC-J2的黏附能力相對于EcNc則下降64%(p=0.002)、相對于EcNc fliC1下降52%(p=0.018)、相對于EcNc fliC2下降50%(p=0.01)。EcNc △fliC回補菌株EcNc △filC/pBR322-fliC與EcNc的特性相一致,對IPEC-J2的黏附能力恢復(fù)到EcNc的黏附水平；用Western blot能檢測到EcNc fliC1、EcNc fliC2鞭毛蛋白的表達(dá),電鏡下亦能觀察到鞭毛絲,但它們在半固體培養(yǎng)基上幾乎不能運動,EcNc fliC1、EcNc fliC2對IPEC-J2的黏附能力相對于EcNc則分別下降26%(p=0.124),29%(p=0.586),差異不顯著；但EcNc fliC1對IPEC-J2的黏附能力比EcNc △fliC高52%(p=0.018),EcNc fliC2對IPEC-J2的黏附能力比EcNc △fliC高50%(p=0.01)。在體內(nèi)腸道定植試驗中,接種后第1 d、第3 d、第7d取樣檢測,各組細(xì)菌在同一腸段(回腸、盲腸或結(jié)腸)的定植能力無顯著差異；但各組細(xì)菌在盲腸的定植數(shù)量高于各自在回腸和結(jié)腸的定植,尤其是接種后第1 d, EcNc/pBR322、EcNc △fliC/pBR322-fliC、EcNc fliC1/pBR322、EcNc filC2/pBR322在盲腸的定植顯著高于其各自在回腸的定植數(shù)量。EcNc還具有F1A、F1C和卷曲菌毛等黏附因子,他們也共同介導(dǎo)和促進(jìn)細(xì)菌在動物體內(nèi)的定植,使得EcNc △filC/pBR322也能在小鼠腸道有效定植。EcNc鞭毛蛋白高變區(qū)分別缺失287-296位或者277-286位10個氨基酸后亦能表達(dá)鞭毛蛋白并形成鞭毛絲,且不影響重組菌在小鼠體內(nèi)的定植能力,說明EcNc鞭毛蛋白高變區(qū)能容許部分氨基酸的缺失。隨后本研究嘗試以鞭毛基因高變區(qū)表面展示外源基因。以重組質(zhì)粒pUC18-fliC為模板,設(shè)計兩對含六聚組氨酸肽(6His)基因的反向PCR引物,反向PCR產(chǎn)物經(jīng)Dpn I、 Exnase TM Ⅱ重組環(huán)化,分別獲得含有嵌合鞭毛基因片段(fliC01、fliC02)的重組質(zhì)粒pUC18-fliC01、pUC18-fliC02, fliC01、fliC02這兩個片段為將六聚組氨酸肽(6His)基因分別插入EcNc fliC高變區(qū)774-775位和792-811位堿基之間的序列。將fliC01、fliC02片段分別插入自殺性載體pRE1 12,獲得重組質(zhì)粒pRE112-fliC01、pRE112-fliC02,再將其分別轉(zhuǎn)化EcNc。通過一次重組和二次重組將嵌合鞭毛基因整合入EcNc基因組中,最終獲得無抗性篩選盒的重組菌株EcNc fliC01、EcNc fliC02。對重組菌株生長狀況、鞭毛形成以及體外細(xì)胞黏附試驗和小鼠體內(nèi)定植試驗分析,結(jié)果表明EcNc fliC01、EcNc fliC02的生長未受影響,表達(dá)的嵌合鞭毛蛋白能被H1多抗或His-Tag單抗識別并且能組裝形成鞭毛絲；EcNc fliC01、EcNc fliC02對IPEC-J2細(xì)胞的黏附能力及小鼠腸道定植能力與EcNc相比無顯著性差異。EcNc鞭毛蛋白插入6His后能將其展呈于菌體表面。在利用EcNc鞭毛成功展示6His后,本研究以重組質(zhì)粒pUC18-fliC為模板,設(shè)計兩對分別含有BVDV (Bovine viral diarrhea virus) NADL毒株E2蛋白B、T細(xì)胞表位基因的反向PCR引物,反向PCR產(chǎn)物經(jīng)Dpn Ⅰ、ExnaseTM Ⅱ重組環(huán)化,分別獲得含有嵌合鞭毛基因片段(fliCB、fliCT)的重組質(zhì)粒pUC18-fliCB、pUC18-fliCT, fliCB、fliCT片段為將B細(xì)胞表位、T細(xì)胞表位基因分別插入fliC基因792-811位堿基之間構(gòu)建的嵌合鞭毛基因片段。將fliCB、fliCT片段分別插入自殺性載體pRE112,獲得重組質(zhì)粒pRE112-fliCB、 pRE112-fliCT,再將其分別轉(zhuǎn)化EcNc。通過一次重組和二次重組將嵌合鞭毛基因整合入EcNc基因組中,篩選獲得無抗性篩選盒的重組菌株EcNc fliCB、EcNc fliCT。兩株重組菌株生長、鞭毛形成以及體外細(xì)胞黏附試驗與EcNc無顯著差異；在半固體平板上,EcNc fliCB無運動性,而EcNc fliCT具有運動性。將EcNc、EcNc fliCB、EcNc fliCT灌胃免疫SPF BALB/c小鼠,二免后一周收集血液和腸道,檢測小鼠體內(nèi)產(chǎn)生抗B、T細(xì)胞表位的特異性抗體IgA、IgG,結(jié)果表明,免疫重組菌株EcNc fliCB能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生抗B細(xì)胞表位的IgG抗體(0.552±0.027),免疫EcNc fliCT同樣能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生抗T細(xì)胞表位IgG抗體(0.515±0.049),空白對照組(免疫EcN)未檢測出針對相應(yīng)包被蛋白的IgG抗體。免疫EcNc fliCB小鼠腸道能檢測出針對B細(xì)胞表位的IgA抗體(0.367±0.030),與空白對照組差異顯著(0.040±0.017；p=0.040)；免疫EcNc fliCT小鼠腸道能檢測出針對T細(xì)胞表位的IgA抗體(0.371±0.034),與空白對照組差異顯著(0.024±0.010;p=0.025)。EcNc fliCB、EcNc fliCT能誘導(dǎo)B、T細(xì)胞表位抗原特異的體液及黏膜免疫應(yīng)答。上述試驗結(jié)果證明EcNc鞭毛蛋白不同高變區(qū)能攜帶一定大小的外源抗原并較好展呈于菌體表面,為優(yōu)質(zhì)益生菌EcN更好的潛在應(yīng)用研究奠定了基礎(chǔ)。
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【學(xué)位授予單位】：揚州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S852.61

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1725975