本文選題：眼斑芫菁　切入點(diǎn)：斑蝥素　出處：《重慶大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：眼斑芫菁(Mylabris cichorii)是鞘翅目(Coleoptera)芫菁科(Meloidae)斑芫菁屬(Mylabris)的昆蟲,是一種世界范圍內(nèi)使用歷史悠久的民間藥,也是中國(guó)藥典收錄的重要?jiǎng)游锼幉闹�。斑蝥素是芫菁科昆蟲在受到外界刺激時(shí)分泌的一種倍半萜類防御性毒素,其合成具有性二型現(xiàn)象,即雄成蟲大量合成斑蝥素,而雌成蟲幾乎不合成,雄蟲在交配時(shí)將斑蝥素作為一種“信物”傳遞給雌蟲,進(jìn)而由雌蟲在產(chǎn)卵時(shí)傳遞給卵作為防衛(wèi)毒素。近年來由于發(fā)現(xiàn)斑蝥素對(duì)多種癌癥具有顯著療效而廣泛受人關(guān)注,也導(dǎo)致其需求量大幅增加,目前芫菁科昆蟲已被列為緊缺的動(dòng)物藥之一。盡管前人對(duì)芫菁科昆蟲有不少的的研究,但都主要集中于生物學(xué)、生理學(xué)、生態(tài)學(xué)、人工養(yǎng)殖、抗癌機(jī)理等方面,對(duì)斑蝥素生物合成途徑的研究甚少,至今斑蝥素生物合成的分子機(jī)制仍不清楚。斑蝥素作為一種毒素如何在芫菁體內(nèi)合成及代謝對(duì)于揭示這一生命現(xiàn)象的奧秘具有重要科學(xué)價(jià)值,同時(shí)也可以為野生資源的合理開發(fā)利用以及斑蝥素的體外生物合成提供理論依據(jù)。本研究以轉(zhuǎn)錄組及數(shù)字基因表達(dá)譜測(cè)序(RNA-seq)為基礎(chǔ),通過代謝通路分析,篩選出可能與斑蝥素生物合成相關(guān)的基因,并對(duì)其中部分重要基因的功能進(jìn)行了研究,探索斑蝥素生物合成的分子機(jī)制,取得的主要研究結(jié)果如下:(1)轉(zhuǎn)錄組de novo(從頭)測(cè)序及數(shù)字基因表達(dá)譜分析鑒定斑蝥素生物合成可能相關(guān)的基因及通路由于眼斑芫菁尚無(wú)基因組數(shù)據(jù),本研究開展了眼斑芫菁雌、雄成蟲混合轉(zhuǎn)錄組de novo測(cè)序,得到了9.19 G的數(shù)據(jù),最終組裝成了29,247個(gè)unigene,其中23,739個(gè)unigene(81.17%)被注釋。有8,580條序列得到了COG分類注釋,并分配至25個(gè)類別,12,951條序列被分到了58個(gè)GO條目上,16,660條序列分布于258個(gè)KEGG通路中,共預(yù)測(cè)了24,358條編碼蛋白序列。分別對(duì)雌、雄成蟲斑蝥素合成高峰期20-25 d的數(shù)字基因表達(dá)譜測(cè)序分析后,獲得了2,465個(gè)差異表達(dá)基因,其中1,468個(gè)基因在雄蟲組中上調(diào)表達(dá),997個(gè)基因下調(diào)表達(dá),有1,506個(gè)差異表達(dá)基因被富集到了249個(gè)KEGG通路中。通過分析與斑蝥素生物合成途徑可能相關(guān)的KEGG通路,鑒定了14個(gè)可能與斑蝥素合成相關(guān)的基因,發(fā)現(xiàn)眼斑芫菁中斑蝥素的生物合成只能通過甲羥戊酸途徑(mevalonate pathway,MVA pathway)途徑,不能通過1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸/2-甲基-D-赤藻糖醇-4-磷酸途徑(DXP/MEP pathway)或兩種途徑的結(jié)合形式。此外,我們認(rèn)為斑蝥素的生物合成可能與保幼激素的合成或代謝有關(guān)。隨后,對(duì)具有代表性的顯著差異表達(dá)的13個(gè)unigene進(jìn)行了熒光定量PCR(rt-qpcr)驗(yàn)證,證明了轉(zhuǎn)錄組和表達(dá)譜測(cè)序分析的可靠性。(2)mcste24、mccyp305a1、mcjheh基因全長(zhǎng)cdna的克隆及生物信息學(xué)分析本研究運(yùn)用染色體步移及3’race技術(shù)對(duì)雄性表達(dá)譜庫(kù)中上調(diào)表達(dá)的全反式法呢醇合成支路中的ste24肽鏈內(nèi)切酶基因ste24、可能與保幼激素合成相關(guān)的基因cyp305a1和保幼激素環(huán)氧化物水解酶基因jheh進(jìn)行了克隆,分別獲得了1237bp、1601bp和1497bp的全長(zhǎng)cdna,編碼433個(gè)、492個(gè)和459個(gè)氨基酸,并分別將它們命名為mcste24(genbank登錄號(hào)ku941585)、mccyp305a1(genbank登錄號(hào)ku941587)和mcjheh(genbank登錄號(hào)ku941586)基因。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),這三個(gè)基因所編碼的蛋白與昆蟲中其相應(yīng)的蛋白存在高度的同源性:mcste24蛋白結(jié)構(gòu)中存在ste24蛋白所共有的hexxhzn2+-金屬蛋白酶信號(hào);mccyp305a1蛋白具有構(gòu)成cyp超家族酶催化中心的保守基序,如hinge、ihelix、helixk、hemebindingloop;mcjheh蛋白具有環(huán)氧化物水解酶特有的催化三聯(lián)體和六個(gè)與陰氧離子洞形成相關(guān)的氨基酸殘基。(3)mcste24、mccyp305a1、mcjheh基因在雌、雄成蟲不同時(shí)期的表達(dá)模式分析通過rt-qpcr對(duì)mcste24、mccyp305a1、mcjheh基因進(jìn)行不同時(shí)期的表達(dá)模式分析發(fā)現(xiàn),這三個(gè)基因在雌、雄成蟲各個(gè)時(shí)期均有表達(dá)。在雄蟲中,三個(gè)基因在羽化后的5-10日齡的表達(dá)量具有較高或升高的趨勢(shì),在15日齡時(shí)均有明顯的下調(diào)表達(dá),而在20-25日齡各基因的表達(dá)量又顯著上調(diào),25日齡達(dá)到高峰之后,25-30日齡表達(dá)量急劇下降,各基因在斑蝥素大量合成前期至大量合成后期的表達(dá)變化趨勢(shì)與斑蝥素含量變化趨勢(shì)呈正相關(guān),說明這三個(gè)基因可能參與斑蝥素的生物合成;此外,在羽化后5-10日齡三個(gè)基因的表達(dá)量均偏高說明這三個(gè)基因可能還與羽化初期雄蟲的性腺發(fā)育有關(guān)。在雌蟲中,三個(gè)基因在5-10日齡表達(dá)量較低或有降低趨勢(shì),在15日齡時(shí)表達(dá)量突然急劇上升且達(dá)到高峰,20-25日齡又顯著降低,而在30日齡表達(dá)量又有所回升,各基因的表達(dá)模式與斑蝥素含量變化不呈正相關(guān),由于雌蟲本身不能大量合成斑蝥素,因而這三個(gè)基因可能參與了雌蟲其他生理活動(dòng),如卵巢發(fā)育、促進(jìn)卵黃發(fā)生、產(chǎn)卵等。比較雌、雄成蟲斑蝥素大量合成前期及高峰期mcste24、mccyp305a1及mcjheh基因的差異表達(dá)模式可以看出,在斑蝥素大量合成前期(15d),雄蟲中的各基因表達(dá)量都比較低,有些甚至顯著低于雌蟲組(mcste24、mccyp305a1基因);而在斑蝥素大量合成期(20-25d),雄蟲體內(nèi)三個(gè)基因表達(dá)量都有急劇的上升,25d時(shí)均超出雌成蟲表達(dá)量的若干倍,而此時(shí)雄性性腺已基本成熟,考慮到眼斑芫菁斑蝥素合成的性二型現(xiàn)象及雄蟲蝥素合成的能力,可以推測(cè)這三個(gè)基因此期的功能應(yīng)該與斑蝥素合成相關(guān)。(4)McSTE24、McCYP305a1、McJHEH基因的RNA干擾通過體外合成McSTE24、McCYP305a1、McJHEH基因的雙鏈RNA(ds RNA),并用微量注射器注射dsRNA的方式對(duì)羽化后第19日齡的雌、雄成蟲進(jìn)行RNA干擾發(fā)現(xiàn),干擾這三個(gè)基因均對(duì)雌、雄蟲斑蝥素的合成造成了影響。干擾組的斑蝥素含量比對(duì)照組顯著下降,說明這三個(gè)基因均可以直接參與斑蝥素的生物合成;同時(shí)還說明眼斑芫菁的雌蟲也可以產(chǎn)生少量斑蝥素,但斑蝥素含量測(cè)定發(fā)現(xiàn),無(wú)論是干擾組還是對(duì)照組,雄蟲體內(nèi)的斑蝥素含量均遠(yuǎn)高于雌蟲,說明雄蟲斑蝥素合成能力強(qiáng)于雌蟲,這與斑蝥素合成的性二型現(xiàn)象相符,至于雌蟲產(chǎn)生斑蝥素的原因還需進(jìn)行深入研究。由于McJHEH可能是眼斑芫菁保幼激素代謝相關(guān)的酶基因,對(duì)該基因干擾后斑蝥素含量的降低表明眼斑芫菁斑蝥素合成可能與保幼激素的代謝相關(guān),但還需進(jìn)一步研究證實(shí)。(5)干擾后對(duì)下游基因表達(dá)量的影響對(duì)干擾后的McSTE24和McCYP305a1基因各自的下游基因進(jìn)行了表達(dá)量變化分析,發(fā)現(xiàn)對(duì)McSTE24基因的干擾直接影響了McCYP305a1基因的表達(dá),但對(duì)McJHEH的作用似乎是一種由于前體的持續(xù)阻斷而導(dǎo)致的負(fù)調(diào)控現(xiàn)象。對(duì)McCYP305a1基因的干擾結(jié)果顯示,McCYP305a1基因可能并不直接控制McJHEH基因的表達(dá),而是由于干擾McCYP305a1基因影響了保幼激素的合成而導(dǎo)致保幼激素滴度失調(diào),從而影響到McJHEH基因的表達(dá)。綜上所述,斑蝥素的生物合成途徑有多種酶參與,存在復(fù)雜的激素調(diào)節(jié)機(jī)制,是個(gè)龐雜的過程。本研究構(gòu)建了首個(gè)眼斑芫菁成蟲轉(zhuǎn)錄組及斑蝥素合成高峰期表達(dá)譜數(shù)據(jù)庫(kù),發(fā)現(xiàn)了芫菁科昆蟲中未報(bào)道過的三個(gè)與斑蝥素合成相關(guān)的基因,明確了它們?cè)谘郯哕据及唑厣锖铣芍械墓δ?初步探索了眼斑芫菁成蟲斑蟊素生物合成途徑,為芫菁科昆蟲的分子遺傳學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:Mylabris cichorium ( Mylabris cichorium ) is one of the most important species of Mylabris ( Mylabris ) . ( 2 ) The cloning and bioinformatics analysis of the full - length cdna of mcste24 , mcDNA305a1 , mcjheh gene were cloned and sequenced . The expression patterns of mcste24 , mcgovern 305a1 and mcjheh gene in male and female adults were significantly decreased at the age of 15 days . ( 4 ) The RNA interference of McSTE24 , McCYP305a1 , McJHEH gene was induced by RNA interference of McSTE24 , McCYP305a1 , McJHEH gene in vitro .

【學(xué)位授予單位】：重慶大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：Q966

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本文編號(hào)：1700577