本文選題：細菌纖維素　切入點：葡糖醋桿菌　出處：《中國科學(xué)院研究生院(東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所)》2016年博士論文

【摘要】：細菌纖維素(Bacterial Cellulose,BC)是葡糖醋桿菌分泌合成的一種胞外多糖。作為新型生物納米材料,已成為微生物合成材料的研究熱點之一,廣泛應(yīng)用于各個領(lǐng)域。然而,葡糖醋桿菌在合成BC過程中會產(chǎn)生大量葡萄糖酸、乙酸等代謝副產(chǎn)物,形成的酸脅迫環(huán)境影響菌體的生長和存活,進而影響B(tài)C的合成。因此,理解酸脅迫下生存和適應(yīng)機制對基礎(chǔ)研究和應(yīng)用方面都有重要意義。本論文主要從葡糖醋桿菌的谷胱甘肽途徑抗氧化,細胞膜脂肪酸的代謝適應(yīng)性,乙醛酸循環(huán)代償途徑三個方面闡釋葡糖醋桿菌耐酸適應(yīng)性機理。同時采用DES結(jié)合60Co-γ復(fù)合誘變,結(jié)合質(zhì)子自殺法篩選低酸高產(chǎn)細菌纖維素突變株。為后續(xù)細菌纖維素高產(chǎn)合成的代謝工程提供科學(xué)依據(jù),BC產(chǎn)量的提高也將有助于其工業(yè)化生存和推廣的快速開展。主要研究結(jié)果如下:酸脅迫導(dǎo)致ROS過度積累,ATP過度消耗,H+-ATPase活性降低,加劇了胞內(nèi)H+的損害,進而導(dǎo)致菌體存活率下降;過度酸脅迫導(dǎo)致總谷胱甘肽和GSH均降低,GSSG增加,GSH/GSSG顯著降低。酶學(xué)分析表明GSH酶活性依然高效表達,但將GSSG轉(zhuǎn)變?yōu)镚SH的關(guān)鍵酶GR活性顯著被抑制。同時這種轉(zhuǎn)變所需的NADPH還原力也被大量消耗。表明酸脅迫下,菌體部分死亡可能是由于氧化還原平衡受損所致。酸脅迫下,NADP-GDH酶活性高效表達,催化谷氨酸脫氨生成α-酮戊二酸和氨的反應(yīng),同時生成NADPH、ATP,表明在嚴重酸脅迫下,菌體通過谷氨酸分解代謝提供能量和還原力抵抗氧化應(yīng)激。比較了酸脅迫下葡糖醋桿菌細胞膜流動性及脂肪酸變化規(guī)律。結(jié)果表明,酸脅迫導(dǎo)致葡糖醋桿菌細胞膜流動性下降,脂不飽和脂肪酸增加,不飽和度上升,鏈長增加。同時發(fā)酵過程中,隨著pH逐漸降低,飽和脂肪酸降低,不飽和脂肪酸增加,特別是C18-1w9c、C19-Cyc的增加。RT-PCR結(jié)果表明des和cfa基因在酸脅迫條件下被激活。外源添加劑實驗結(jié)果表明脂肪酸合成參與調(diào)節(jié)細胞膜脂肪酸結(jié)構(gòu)組成的改變,同時這種調(diào)節(jié)存在反饋抑制,抑制脂肪酸合成會增強葡糖醋桿菌對酸脅迫的敏感性,導(dǎo)致存活率降低。結(jié)果表明葡糖醋桿菌的調(diào)節(jié)細胞膜脂肪酸的轉(zhuǎn)變是其耐酸存活的一種生存機制,而脂肪酸合成過程參加調(diào)節(jié)這種脂肪酸轉(zhuǎn)變,改善葡糖醋桿菌的耐酸適應(yīng)性。酸脅迫條件下G6PDH和IDH等酶活降低,導(dǎo)致PPP途徑和TCA途徑代謝受阻,NADPH合成降低。乙醛酸循環(huán)途徑關(guān)鍵酶ICL、MS酶活性顯著增加。與此對應(yīng),乙醛酸循環(huán)產(chǎn)物蘋果酸和琥珀酸,以及作為抗氧化劑的α-酮戊二酸顯著增加,而丙酮酸和檸檬酸積累降低。基因表達數(shù)據(jù)表明酸脅迫激活了應(yīng)激蛋白,aatA、grpE、dnaK、dnaJ的表達。表明在酸脅迫下,葡糖醋桿菌的乙醛酸循環(huán)途徑作為代償途徑,在對TCA,糖異生的回補和能量供應(yīng)方面發(fā)揮重要作用,同時生成的α-酮戊二酸以及菌體的應(yīng)激蛋白參與抵抗酸脅迫下的氧化應(yīng)激,保障了葡糖醋桿菌在酸脅迫下的存活。運用DES化學(xué)誘變和60Co-γ復(fù)合誘變,結(jié)合質(zhì)子自殺法獲得了產(chǎn)酸少的細菌纖維素高產(chǎn)菌株Br-3和Co-5,以及一株低產(chǎn)突變株Br-12。運用AFLP對突變菌株進行基因多態(tài)性分析,并對其中比較顯著的5個差異片段進行測序發(fā)現(xiàn),Br-12突變株的3個差異基因片段分別對應(yīng)著編碼合成TonB依賴性受體蛋白、胞外多糖輸出蛋白(PePr)和假定蛋白基因序列高度同源;而突變株Co-5的兩條差異基因片段中一條與acsD基因同源,另一條對應(yīng)著UDPG差向異構(gòu)酶。對突變菌株的代謝分析表明,葡萄糖酸對細菌纖維素的產(chǎn)量影響較大,這也同時表明基因差異可直接影響菌體代謝及產(chǎn)物產(chǎn)量,而代謝結(jié)合基因信息也可以快速篩選和鑒定相應(yīng)的突變體。
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【學(xué)位授予單位】：中國科學(xué)院研究生院(東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：Q936

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本文編號：1693636