發(fā)布時間：2018-03-30 22:05

  本文選題：Reverse-4D文庫　切入點：AvBDs　出處：《浙江大學》2015年博士論文

【摘要】：畫眉(Hwamei, Garrulax canorus)為鳥類最大的目——雀形目,的一種鳴禽,因其聲音婉轉悠揚成為中華社區(qū)最普遍的籠養(yǎng)鳥類之一。先天性免疫是第一線的免疫防御系統(tǒng),在體液免疫應答前發(fā)揮著重要的作用。鳥類p防御素基因(avian beta-defensins, AvBDs)是鳥類先天性免疫系統(tǒng)不可分割的重要組成部分。鳥類是動物性致病菌的重要宿主之一,因此對于鳥類防御素系統(tǒng)的研究有助于理解鳥類的免疫防御機制。細菌人工染色體(Bacterial Artificial Chromosomes, BACs)文庫廣泛應用于物理作圖和基因組測序等方面。BAC文庫的構建是一項費時費力的工作,相關參數和步驟的改進都會顯著提高構建的文庫質量,改進后續(xù)的基因測序、組裝過程，從而降低建庫和測序成本。本文中,作者構建了6.23倍基因組覆蓋度的畫眉Reverse-4D文庫,文庫由14個超級庫,55個亞庫所構成,包含約60500個克隆。通過對隨機挑選的110個克隆進行分析，發(fā)現此文庫的平均插入片段大小約為133.8kb。因此對該文庫進行篩選,得到任一基因的概率約為99.80%。文庫的構建過程中,作者從細胞包埋濃度、電脈參數、連接條件和電轉化參數四個方面對文庫的構建過程進行了優(yōu)化。首先,作者對包埋細胞濃度進行了優(yōu)化,發(fā)現最佳包埋濃度約為2.5×108cells/mL;其次,為了減少脈沖場電泳中小分子片段的共遷移作用,作者以三次電泳替代了兩次電泳,其中前兩次電泳在同一塊脈沖場膠中完成,有效地去除了小分子和減少了物理剪切作用,產生了較大的片段用于后續(xù)的連接過程；第三,作者將DNA和vector勺比率限制為DNA/vector=1/5-1/10,降低了DNA的用量,有利于減少嵌合體克隆的產生；第四,經過試驗,確定了最佳的電轉化參數為200ohms,25μF,1.5kV,其延長的電轉化時間有利于導入更大的片段。畫眉的防御素基因簇由兩個BAC克隆拼接而成,BAC44 (SP6B4D3)和BAC55 (SP1-9B6E10),大小分別為165kb和160kb。防御素基因區(qū)域的大小約為177kb,包含30個防御素基因,遠大于珍珠鳥相對應區(qū)域大小(127kb)。研究發(fā)現畫眉防御素有以下幾個主要特征：第一,AvBD1和AvBD3分別復制產生了4個和16個子代基因,不同于已測序鳥類中的串聯分布,AvBD1和AvBD3形成鑲嵌排布的格局；第二,畫眉中沒有發(fā)現AvBD167β和AvBD14,這個結果與珍珠鳥的研究結果一致,證明這兩個基因在雀形目中缺失；第三,除以上基因外的基因為直系同源基因,它們在基因位置、方向上保持了高度的線性關系；第四,重復序列在畫眉防御素區(qū)域內占有較大比重(22.56%),高于原雞(17.11%),且其成分與原雞有較大差異。原雞中的主要成分為反轉錄元件的LINEs(占重復序列的86.81%,主要是CR1),而畫眉中LINEs僅占39.32%,其它的重復序列主要為LTRs元件(51.85%)；第五,重復序列元件作為進化的代理,直接或間接地引起防御素基因拷貝數的變化,復制過程遵循DDSA模型。廣泛分布的重復序列為非同源重組提供了重組位點,而且重復序列改變了染色體構象,可能造成基因組的不穩(wěn)定性,以利于發(fā)生復制事件。熒光原位雜交技術(FISH)實驗表明,畫眉防御素的兩個BAC定位于第三號染色體長臂的末端,染色體末端有利于發(fā)生重組,因此可能賦予防御表基因更高的變異性和多態(tài)性。畫眉防御素的定位和基因組測序鳥類的防御素定位相同,說明了防御素基因位置的保守性。防御素的熒光信號僅定位于一對同源染色體上,這不同于哺乳類(人類和小鼠)中的情況,哺乳類的防御素基因簇散布于四對或五對同源染色體上。組織特異性表達分析實驗表明,大部分直系同源基因(AvBD2、AvBD4、 AvBD5、AvBD9、AvBD10、AvBD11和AvBD13)在調查的13個組織樣品中呈現廣泛的表達。少量直系同源基因(AvBD8和AvBD12)和所有的旁系基因呈現出組織特異性的表達。有趣的是,發(fā)生復制的旁系基因主要表達于上下呼吸道、舌和脾,少量表達于其它器官。鑒于呼吸道、舌和脾在氣體交換、體溫調節(jié)、聲音和免疫等方面的重要作用,這可能暗示了在進化過程中,旁系基因受到正選擇作用,從而產生了一系列的復制過程。此外,AvBD1和AvBD3派生基因的組織特異性表達可能有利于降低呼吸系統(tǒng)的疾病易感性。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：Q78

【參考文獻】

相關期刊論文 前2條

1 張學博;黃鑫欣;周荔平;張信文;孫穎郁;曾少舉;左明雪;;成年畫眉前腦新生神經細胞的增殖和定位[J];海南師范學院學報(自然科學版);2005年04期

2 吉敬合，韓春璉，馬志遠;一種畫眉（Stachyris sp．）雌性鳴聲波形和頻譜特征[J];山西大學學報(自然科學版);1995年03期

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1 何珂;紅腹錦雞SSR和Ⅱ類MHC位點的分離及種群遺傳結構分析[D];浙江大學;2012年

2 朱英;大熊貓Ⅰ類MHC分子標記系統(tǒng)的建立及其適應性進化研究[D];浙江大學;2012年

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本文編號：1687834