本文選題：Reverse-4D文庫(kù)　切入點(diǎn)：AvBDs　出處：《浙江大學(xué)》2015年博士論文

【摘要】：畫(huà)眉(Hwamei, Garrulax canorus)為鳥(niǎo)類最大的目——雀形目,的一種鳴禽,因其聲音婉轉(zhuǎn)悠揚(yáng)成為中華社區(qū)最普遍的籠養(yǎng)鳥(niǎo)類之一。先天性免疫是第一線的免疫防御系統(tǒng),在體液免疫應(yīng)答前發(fā)揮著重要的作用。鳥(niǎo)類p防御素基因(avian beta-defensins, AvBDs)是鳥(niǎo)類先天性免疫系統(tǒng)不可分割的重要組成部分。鳥(niǎo)類是動(dòng)物性致病菌的重要宿主之一,因此對(duì)于鳥(niǎo)類防御素系統(tǒng)的研究有助于理解鳥(niǎo)類的免疫防御機(jī)制。細(xì)菌人工染色體(Bacterial Artificial Chromosomes, BACs)文庫(kù)廣泛應(yīng)用于物理作圖和基因組測(cè)序等方面。BAC文庫(kù)的構(gòu)建是一項(xiàng)費(fèi)時(shí)費(fèi)力的工作,相關(guān)參數(shù)和步驟的改進(jìn)都會(huì)顯著提高構(gòu)建的文庫(kù)質(zhì)量,改進(jìn)后續(xù)的基因測(cè)序、組裝過(guò)程，從而降低建庫(kù)和測(cè)序成本。本文中,作者構(gòu)建了6.23倍基因組覆蓋度的畫(huà)眉Reverse-4D文庫(kù),文庫(kù)由14個(gè)超級(jí)庫(kù),55個(gè)亞庫(kù)所構(gòu)成,包含約60500個(gè)克隆。通過(guò)對(duì)隨機(jī)挑選的110個(gè)克隆進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)此文庫(kù)的平均插入片段大小約為133.8kb。因此對(duì)該文庫(kù)進(jìn)行篩選,得到任一基因的概率約為99.80%。文庫(kù)的構(gòu)建過(guò)程中,作者從細(xì)胞包埋濃度、電脈參數(shù)、連接條件和電轉(zhuǎn)化參數(shù)四個(gè)方面對(duì)文庫(kù)的構(gòu)建過(guò)程進(jìn)行了優(yōu)化。首先,作者對(duì)包埋細(xì)胞濃度進(jìn)行了優(yōu)化,發(fā)現(xiàn)最佳包埋濃度約為2.5×108cells/mL;其次,為了減少脈沖場(chǎng)電泳中小分子片段的共遷移作用,作者以三次電泳替代了兩次電泳,其中前兩次電泳在同一塊脈沖場(chǎng)膠中完成,有效地去除了小分子和減少了物理剪切作用,產(chǎn)生了較大的片段用于后續(xù)的連接過(guò)程；第三,作者將DNA和vector勺比率限制為DNA/vector=1/5-1/10,降低了DNA的用量,有利于減少嵌合體克隆的產(chǎn)生；第四,經(jīng)過(guò)試驗(yàn),確定了最佳的電轉(zhuǎn)化參數(shù)為200ohms,25μF,1.5kV,其延長(zhǎng)的電轉(zhuǎn)化時(shí)間有利于導(dǎo)入更大的片段。畫(huà)眉的防御素基因簇由兩個(gè)BAC克隆拼接而成,BAC44 (SP6B4D3)和BAC55 (SP1-9B6E10),大小分別為165kb和160kb。防御素基因區(qū)域的大小約為177kb,包含30個(gè)防御素基因,遠(yuǎn)大于珍珠鳥(niǎo)相對(duì)應(yīng)區(qū)域大小(127kb)。研究發(fā)現(xiàn)畫(huà)眉防御素有以下幾個(gè)主要特征：第一,AvBD1和AvBD3分別復(fù)制產(chǎn)生了4個(gè)和16個(gè)子代基因,不同于已測(cè)序鳥(niǎo)類中的串聯(lián)分布,AvBD1和AvBD3形成鑲嵌排布的格局；第二,畫(huà)眉中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)AvBD167β和AvBD14,這個(gè)結(jié)果與珍珠鳥(niǎo)的研究結(jié)果一致,證明這兩個(gè)基因在雀形目中缺失；第三,除以上基因外的基因?yàn)橹毕低椿?它們?cè)诨蛭恢�、方向上保持了高度的線性關(guān)系；第四,重復(fù)序列在畫(huà)眉防御素區(qū)域內(nèi)占有較大比重(22.56%),高于原雞(17.11%),且其成分與原雞有較大差異。原雞中的主要成分為反轉(zhuǎn)錄元件的LINEs(占重復(fù)序列的86.81%,主要是CR1),而畫(huà)眉中LINEs僅占39.32%,其它的重復(fù)序列主要為L(zhǎng)TRs元件(51.85%)；第五,重復(fù)序列元件作為進(jìn)化的代理,直接或間接地引起防御素基因拷貝數(shù)的變化,復(fù)制過(guò)程遵循DDSA模型。廣泛分布的重復(fù)序列為非同源重組提供了重組位點(diǎn),而且重復(fù)序列改變了染色體構(gòu)象,可能造成基因組的不穩(wěn)定性,以利于發(fā)生復(fù)制事件。熒光原位雜交技術(shù)(FISH)實(shí)驗(yàn)表明,畫(huà)眉防御素的兩個(gè)BAC定位于第三號(hào)染色體長(zhǎng)臂的末端,染色體末端有利于發(fā)生重組,因此可能賦予防御表基因更高的變異性和多態(tài)性。畫(huà)眉防御素的定位和基因組測(cè)序鳥(niǎo)類的防御素定位相同,說(shuō)明了防御素基因位置的保守性。防御素的熒光信號(hào)僅定位于一對(duì)同源染色體上,這不同于哺乳類(人類和小鼠)中的情況,哺乳類的防御素基因簇散布于四對(duì)或五對(duì)同源染色體上。組織特異性表達(dá)分析實(shí)驗(yàn)表明,大部分直系同源基因(AvBD2、AvBD4、 AvBD5、AvBD9、AvBD10、AvBD11和AvBD13)在調(diào)查的13個(gè)組織樣品中呈現(xiàn)廣泛的表達(dá)。少量直系同源基因(AvBD8和AvBD12)和所有的旁系基因呈現(xiàn)出組織特異性的表達(dá)。有趣的是,發(fā)生復(fù)制的旁系基因主要表達(dá)于上下呼吸道、舌和脾,少量表達(dá)于其它器官。鑒于呼吸道、舌和脾在氣體交換、體溫調(diào)節(jié)、聲音和免疫等方面的重要作用,這可能暗示了在進(jìn)化過(guò)程中,旁系基因受到正選擇作用,從而產(chǎn)生了一系列的復(fù)制過(guò)程。此外,AvBD1和AvBD3派生基因的組織特異性表達(dá)可能有利于降低呼吸系統(tǒng)的疾病易感性。
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【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：Q78

【參考文獻(xiàn)】

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2 吉敬合，韓春璉，馬志遠(yuǎn);一種畫(huà)眉（Stachyris sp．）雌性鳴聲波形和頻譜特征[J];山西大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);1995年03期

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本文編號(hào)：1687834