發(fā)布時(shí)間：2018-03-29 03:32

  本文選題：蛋白晶體三維結(jié)構(gòu)　切入點(diǎn)：LBD家族蛋白　出處：《西北農(nóng)林科技大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：LBD家族蛋白通過精確調(diào)控其下游基因的時(shí)空特異性表達(dá)來控制植物的發(fā)育模式。它們參與高等植物的許多生長(zhǎng)發(fā)育和代謝過程,如分生組織分化、葉片發(fā)育、花序形態(tài)建成、花粉發(fā)育和側(cè)根發(fā)育等。最近的研究顯示,LBD家族蛋白還與植物再生、光形態(tài)建成及疾病易感性等密切相關(guān)。LBD蛋白是高等植物特有的,它們?cè)诟叩戎参镏袕V泛分布,目前,模式植物擬南芥中已發(fā)現(xiàn)43種LBD蛋白,重要糧食作物水稻和玉米則分別有35種和44種LBD蛋白被發(fā)現(xiàn)。LOB結(jié)構(gòu)域是位于LBD蛋白N端的高度保守的功能結(jié)構(gòu)域,已有研究表明,其和LBD蛋白的二聚化及DNA結(jié)合特性密切相關(guān)。本研究中,我們解析了LBD家族蛋白圓錐小麥Ramosa2的N端LOB結(jié)構(gòu)域(TtRa2 LD)的晶體三維結(jié)構(gòu),這是已報(bào)道的第一個(gè)LOB結(jié)構(gòu)域的三維結(jié)構(gòu),其分辨率可達(dá)1.88?。TtRa2 LD具有獨(dú)特的空間折疊結(jié)構(gòu)特征。由晶體結(jié)構(gòu)可知,TtRa2 LD以二聚體的形式存在,每個(gè)對(duì)稱單元包含兩個(gè)中心對(duì)稱的單體蛋白。每個(gè)單體蛋白折疊成5個(gè)α螺旋,有5種明顯的構(gòu)件組成:1個(gè)緊湊的Zinc finger模體、1個(gè)由兩個(gè)互相垂直的α螺旋(α2和α3)組成的GAS模體、1個(gè)含長(zhǎng)α螺旋(α5)的coiled coil結(jié)構(gòu)以及連接G AS模體和coiled coil結(jié)構(gòu)的α4和DPVYG模體。TtRa2 LD的鋅指模體是一類新的Cys4型鋅指結(jié)構(gòu),其由1個(gè)α螺旋(α1)和其兩端的無規(guī)則卷曲片段組成。其和已知的Cys4型鋅指蛋白沒有序列和結(jié)構(gòu)同源性,而是與GAL4的部分Zn2/Cys6鋅指模體在結(jié)構(gòu)上比較相近。鋅指模體中4個(gè)保守的半胱氨酸殘基:Cys28、Cys31、Cys38和Cys42和位于四面體中心的Zn離子形成配位鍵從而維持其特定的穩(wěn)定構(gòu)象。DNA結(jié)合實(shí)驗(yàn)和圓二色譜實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,隨著EDTA濃度的升高,TtRa2 LD的二級(jí)結(jié)構(gòu)也會(huì)發(fā)生改變,其DNA結(jié)合活性也會(huì)隨之下降。這說明,Zn2+對(duì)鋅指模體維持其有效結(jié)合DNA的正確構(gòu)象是至關(guān)重要的。TtRa2 LD的Coiled coil結(jié)構(gòu)中的疏水作用是TtRa2 LD二聚化的主要作用力,此區(qū)域的鹽橋連接及其C末端的π-πstacking并不是維持其二聚化所必須的。雙分子熒光互補(bǔ)試驗(yàn)和DNA結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,Tt Ra2 LD在植物細(xì)胞內(nèi)能形成同源二聚體,Coiled coil結(jié)構(gòu)介導(dǎo)的二聚化與TtRa2 LD的DNA結(jié)合活性密切相關(guān)。TtRa2 LD的GAS模體由2個(gè)互相垂直的α螺旋α2和α3組成,它們通過1個(gè)位于中心的高度保守的Gly64來連接。TtRa2 LD的α4和α5之間通過1個(gè)保守的DPVYG模體連接,DPVYG模體中氨基酸殘基之間的氫鍵相互作用能使α4和α5之間形成穩(wěn)定的近直角構(gòu)象,這有助于TtRa2 LD二聚體的形成。GAS模體、α4和DPVYG模體共同參與穩(wěn)定TtRa2 LD二聚體的空間結(jié)構(gòu)。TtRa2 LD二聚體中1個(gè)α4的Arg94、Glu90能分別和另1個(gè)α4’的Glu90’、Arg94’形成兩對(duì)鹽橋連接;其1個(gè)GAS模體的Val62和Asn67還能分別和另1個(gè)對(duì)稱的GAS模體的Asn 67’和Val62’之間形成氫鍵連接,從而穩(wěn)定TtRa2 LD二聚體。點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)證明了TtRa2 LD二聚體中兩個(gè)α4之間形成的鹽橋連接和二聚體的穩(wěn)定及DNA結(jié)合活性緊密相關(guān),其可能起到精確控制TtRa2 LD二聚體中兩個(gè)鋅指模體之間的相對(duì)位置的作用,而TtRa2 LD二聚體中2個(gè)單體蛋白的GAS模體之間的互作則存在著一定的靈活性。本研究基于LOB結(jié)構(gòu)域的三維空間結(jié)構(gòu),利用分子動(dòng)力學(xué)模擬及位點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)建立并驗(yàn)證了LOB結(jié)構(gòu)域-DNA互作的Docking模型。根據(jù)模型可知,TtRa2 LD利用其Zinc finger模體中位于α1下游的柔性環(huán)插入到靶DNA的大溝中,從而對(duì)LBD motif進(jìn)行識(shí)別和結(jié)合。點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明,TtRa2 LD主要依靠柔性環(huán)中的Arg35、Arg36對(duì)LBD motif進(jìn)行識(shí)別和結(jié)合,Lys37也在一定程度上參與其對(duì)LBD motif的結(jié)合。TtRa2 LD對(duì)于含兩個(gè)回文LBD motif但間距不同的DNA底物的結(jié)合能力也有明顯差異。其對(duì)間隔序列長(zhǎng)度為4bp、6bp的DNA底物的結(jié)合能力較強(qiáng),而當(dāng)間隔序列長(zhǎng)度縮短為1bp或增加到8bp、12bp后,TtRa2 LD對(duì)其結(jié)合能力也會(huì)明顯降低。這說明,Tt Ra2 LD對(duì)其靶DNA的識(shí)別和結(jié)合受2個(gè)回文LBD motif之間不同間距的限制,但也存在一定程度的靈活性。
[Abstract]:The specific expression pattern of LBD protein family through the precise regulation of the downstream gene to control plant growth and development. Many of their metabolic processes in higher plants, such as meristem differentiation, leaf development, inflorescence morphogenesis, pollen development and lateral root development. Recent studies show that LBD family proteins and plant regeneration. Photomorphogenesis and disease susceptibility is closely related to higher.LBD protein is unique to plants, they are widely distributed in higher plants, at present, 43 LBD proteins have been found in plants, an important crop of rice and maize were 35 and 44 LBD protein was found in.LOB domain in LBD protein N the end of the highly conserved functional domains, studies have shown that dimerization and DNA binding protein LBD and its characteristics are closely related. In this study, we analyzed LBD protein family circle 閿ュ皬楹amosa2鐨凬绔疞OB緇撴瀯鍩，

本文編號(hào)：1679383