本文選題：單細(xì)胞　切入點(diǎn)：代謝物　出處：《清華大學(xué)》2015年博士論文

【摘要】：由于不同的細(xì)胞個(gè)體之間具有差異性,為了如實(shí)地反映細(xì)胞在結(jié)構(gòu)和功能上對生物系統(tǒng)的正常運(yùn)轉(zhuǎn)所起到的作用,就必須從單細(xì)胞水平上對細(xì)胞中物質(zhì)的組成和含量進(jìn)行分析研究,因而單細(xì)胞分析的概念在近年來廣受關(guān)注。但是單細(xì)胞分析研究卻由于細(xì)胞的極小體積,細(xì)胞中極多的物質(zhì)種類和極少的物質(zhì)含量而成為具有挑戰(zhàn)性的課題。本文針對單細(xì)胞分析的難點(diǎn),設(shè)計(jì)了兩種質(zhì)譜單細(xì)胞分析方法,并將這兩種方法應(yīng)用到實(shí)際的細(xì)胞代謝物檢測中。主要研究成果如下:1.提出了溶劑輔助電場誘導(dǎo)解吸附/離子化(SAEFIDI)質(zhì)譜分析方法,實(shí)現(xiàn)了小體積高鹽樣品中痕量待測分子的檢測。該方法利用了鹽和待測分子在結(jié)晶時(shí)自發(fā)分離的現(xiàn)象,在Nano-tip中實(shí)現(xiàn)了pL級樣品中鹽和待測分子的分離;并使用SAEFIDI對Nano-tip頂端的待測分子進(jìn)行原位解吸附/離子化,避免了對待測分子的稀釋,實(shí)現(xiàn)了高靈敏度的檢測。此外,由于分離過程是自發(fā)發(fā)生的,有效地避免了人為操作可能帶來的污染和樣品損失,進(jìn)一步保證了檢測靈敏度。2.將所建立的SAEFIDI質(zhì)譜分析方法應(yīng)用于動(dòng)物細(xì)胞分裂過程中重要代謝物的含量變化研究中。在三維平臺的幫助下,用Nano-tip將特定體積的溶劑滴加到細(xì)胞表面,對細(xì)胞中的小分子代謝物進(jìn)行萃取。之后將萃取得到的樣品溶液吸回到Nano-tip中,并利用SAEFIDI實(shí)現(xiàn)樣品的檢測。研究發(fā)現(xiàn),在細(xì)胞分裂過程中,多種代謝物的含量均有顯著變化。此外,我們還通過同位素標(biāo)記法對細(xì)胞中三磷酸腺苷(ATP)、二磷酸腺苷(ADP)和單磷酸腺苷(AMP)的合成代謝進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示ATP、ADP和AMP的生物合成與葡萄糖的磷酸戊糖途徑(PPP)密切相關(guān)。3.建立了基于探針電噴霧離子化(PESI)的質(zhì)譜單細(xì)胞分析方法,并在單細(xì)胞水平和亞細(xì)胞水平上對洋蔥細(xì)胞中的代謝物進(jìn)行了檢測。該方法使用尖端尺寸僅有1~5μm的金屬鎢針作為富集探針,在三維移動(dòng)平臺的精確操控下,刺入細(xì)胞中的特定部位富集代謝物。然后通過PESI對探針上所富集的代謝物進(jìn)行原位解吸附/離子化,并與質(zhì)譜聯(lián)用進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示,洋蔥鱗莖中不同種類的細(xì)胞在物質(zhì)的組成和含量上均有顯著差異。而同種類的細(xì)胞雖然具有相近的物質(zhì)組成,但是在物質(zhì)的含量仍有一定差別。亞細(xì)胞水平的檢測結(jié)果則顯示,在洋蔥細(xì)胞的細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)中,物質(zhì)的組成和含量均有差異。
[Abstract]:Because of the difference between different cell individuals, in order to reflect the function of cell in structure and function to the normal operation of biological system, It is necessary to analyze the composition and content of substances in cells at the single cell level, so the concept of single cell analysis has attracted much attention in recent years. However, the study of single cell analysis is due to the very small volume of cells. In this paper, two methods of mass spectrometry single cell analysis are designed for the difficulty of single cell analysis. These two methods have been applied to the detection of cell metabolites. The main research results are as follows: 1. A solvent-assisted electric field induced desorption / ionization SAEFIDI mass spectrometry method is proposed. The detection of trace molecules in small volume and high salt samples was carried out. The method utilized the phenomenon of spontaneous separation of salt and the molecules to be tested during crystallization, and achieved the separation of salt from the molecules to be tested in Nano-tip. SAEFIDI is used for in situ desorption / ionization of the molecules to be tested at the top of Nano-tip, which avoids dilution of the tested molecules and achieves high sensitivity detection. In addition, the separation process occurs spontaneously. Effectively avoiding possible contamination and sample loss caused by human operations, The SAEFIDI mass spectrometry method was applied to study the changes of important metabolites in the course of animal cell division. With the help of three-dimensional platform, A specific volume of solvent was added to the cell surface with Nano-tip to extract the metabolites of small molecules in the cell. Then the extracted sample solution was absorbed back into the Nano-tip, and the sample was detected by SAEFIDI. During cell division, the contents of various metabolites changed significantly. In addition, The biosynthesis and metabolism of adenosine triphosphate ATP (adenosine diphosphate) and adenosine monophosphate (AMP) in cells were also studied by isotope labeling. The results showed that the biosynthesis of ATP ADP and AMP was closely related to the glucose pentose phosphate pathway. A single cell mass spectrometric analysis method based on probe electrospray ionization (PESI) was established. The metabolites in onion cells were detected at the single cell level and subcellular level. The method used a metal tungsten needle with a tip size of only 1 ~ 5 渭 m as a enrichment probe under the precise manipulation of a three-dimensional mobile platform. In situ desorption / ionization of the metabolites enriched on the probe by PESI, and detection by mass spectrometry. There were significant differences in the composition and content of substances between different kinds of cells in onion bulb, while the same type of cells had similar material composition, but there were still some differences in the content of substance. The results of subcellular level showed that, The composition and content of substances in the nucleus and cytoplasm of onion cells are different.
【學(xué)位授予單位】：清華大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：Q2-33;O657.63

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本文編號：1672159