本文選題：8-羥基鳥嘌呤DNA糖基化酶1(OGG1)　切入點：8-羥基鳥嘌呤(8-oxoG)　出處：《東北師范大學》2017年博士論文

【摘要】：有氧呼吸的有機體時刻都在面臨自身代謝產生的,或外界環(huán)境因子造成的活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)的侵襲。細胞內ROS水平超過清除酶系統(tǒng)處理能力的氧化狀態(tài)被稱為氧化應激(oxidative stress)。氧化應激會導致各種細胞內生物大分子(包括蛋白質、脂質及核酸)的氧化。ROS在DNA上造成的氧化性堿基的主要類型是8-羥基鳥嘌呤(8-oxoG)。8-羥基鳥嘌呤DNA糖基化酶1(OGG1)是特異性修復8-oxoG的修復蛋白,通過OGG1起始的堿基切除修復途徑(OGG1-BER)將8-oxoG識別出來并更正為正確的堿基。為了研究8-oxoG在DNA中積累的效應和OGG1在病理生理過程中的作用,研究人員培育出Ogg1敲除(Ogg1-/-)的小鼠。出乎意料的是,基因組上異常過量的8-oxoG并不影響胚胎發(fā)育或小鼠的壽命;而且,Ogg1-/-的小鼠對炎癥沒有明顯的反應,表現(xiàn)為細胞內促炎因子的表達降低和炎癥細胞浸潤不足。由于OGG1的功能受到影響時,促炎基因的表達降低,因此我們假設:氧化應激時,OGG1結合到到轉錄因子識別位點內或鄰近部位的8-oxoG時,能夠調節(jié)轉錄因子的結合和基因的表達。基因啟動子區(qū)域的損傷堿基,尤其通過氧化反應產生的損傷堿基,能夠改變DNA-蛋白質之間的相互作用,從而調節(jié)基因表達的效應。我們認為這種損傷本身,以及DNA損傷修復的過程,能夠影響基因表達的模式;研究這一過程所涉及的分子機制有助于我們清楚理解DNA損傷修復和轉錄調節(jié)之間的關系。在本研究中,我們用細胞因子(TNFα)處理細胞以模擬氧化應激的狀態(tài),結合siRNA介導的基因沉默、染色質免疫沉淀(ChIP)和ChIP-偶聯(lián)的測序(ChIP-seq)、雙報告實驗、蛋白質免疫印跡、RT-qPCR和凝膠遷移實驗(EMSA)等實驗技術探討基因的啟動子區(qū)8-oxoG損傷堿基的存在對于轉錄的影響,以及OGG1修復蛋白參與轉錄調節(jié)的作用機制。本研究的結果表明:(1)氧化應激時,OGG1修復蛋白能夠迅速識別染色質中啟動子區(qū)域的氧化損傷底物,隨后招募轉錄因子募集到結合的保守區(qū)域,這不僅有效促進了轉錄因子的大量結合,同時在時間上大大縮短了轉錄因子識別染色質中的保守序列所需要的時間,為氧化應激狀態(tài)下特異性基因的及時表達提供良好的先決條件;(2)OGG1修復蛋白還能夠影響NF-κB調節(jié)的基因啟動子活性,從而直接調節(jié)基因的轉錄水平;(3)活性氧不僅氧化攻擊DNA,產生氧化性損傷堿基,蛋白質也會被氧化修飾,OGG1蛋白的半胱氨酸被氧化導致堿基切除活性受到抑制,基因組的完整性為轉錄的發(fā)生提供可能;(4)損傷堿基的存在和DNA修復酶能夠特異性地調節(jié)基因表達,在一定時間和空間內,DNA損傷和轉錄調控具有相互促進的作用;(5)通過以上分子機制的作用,OGG1修復蛋白在NF-κB起始的轉錄調控過程中產生的分子效應是促進基因的表達。我們的研究揭示出DNA損傷修復酶OGG1轉錄活化的新機制,即OGG1識別啟動子區(qū)氧化損傷的產物8-oxoG時能夠促進并加速NF-κB與DNA的結合,從而有助于基因的表達;機體的組織、細胞在遭受病原物、環(huán)境因子的侵襲時ROS迅速升高,先天性免疫反應所需要的促炎細胞因子、趨化因子的表達高度依賴ROS信號,而這類基因的啟動子都是高GC含量的,并含有多個NF-κB結合位點,有機體的氧化損傷應答是一種非常重要的先天免疫防御機制,我們的研究表明傳統(tǒng)觀念上的DNA損傷在特定的時間和空間內具有重要的轉錄應答功能;氧化應激條件下,OGG1識別損傷的機制可能成為限定NF-κB轉錄調節(jié)的特異性前提條件。
[Abstract]:Aerobic organisms are always in the face of their metabolism, active oxygen caused or external environmental factors (Reactive Oxygen, Species, ROS) of the invasion. The oxidation state of the intracellular level of ROS than the scavenging enzyme processing ability of the system is called oxidative stress (oxidative stress). Oxidative stress can lead to a variety of cell biological macromolecules in (including protein, lipid and nucleic acid) main types of oxidative base oxidation caused by.ROS on DNA is 8- 8-hydroxyguanine (8-oxoG).8- oxoguanine DNA glycosylase 1 (OGG1) repair protein specific 8-oxoG repair, OGG1 started by the base excision repair pathway (OGG1-BER) 8-oxoG identified and corrected for the correct base. In order to study 8-oxoG effect and OGG1 accumulation in DNA in the pathophysiologic process, the researchers created Ogg1 knockout (Ogg1-/) mice unexpectedly. Is that the genome 8-oxoG abnormal excess does not affect embryonic development or the lifespan of mice; moreover, Ogg1-/- mice showed no response to inflammation, intracellular expression of pro-inflammatory cytokines and reduce the infiltration of inflammatory cells. Due to lack of the function of OGG1 is affected, decrease the expression of proinflammatory genes, so we assume that oxidative stress, OGG1 binding to transcription factor recognition sites within or adjacent parts of the 8-oxoG, capable of binding and gene expression of transcription factor gene promoter. The damage to the base region, especially the base damage by oxidation reaction to produce, can change the interaction between protein DNA- to regulate gene expression, effect. We believe that this injury, and the repair of DNA damage, can influence patterns of gene expression; molecular mechanism of the process involved in the study will help us A clear understanding of the relationship between DNA repair and transcription regulation. In this study, we used cytokine (TNF alpha) treated cells to simulate the oxidative stress state, combined with the siRNA mediated gene silencing and chromatin immunoprecipitation (ChIP) sequencing and coupled ChIP- (ChIP-seq), two experimental report, immune protein Western blot, RT-qPCR and gel shift assay (EMSA) and other experimental techniques to investigate the 8-oxoG gene promoter region of the base damage of the presence of the transcriptional effects, and OGG1 repair proteins involved in the mechanism of transcriptional regulation. The results of this study show that: (1) oxidative stress, OGG1 repair proteins can quickly identify oxidative damage start sub substrate the chromatin, then recruit transcription factor to raise the conservative region combined, which not only effectively promote a large number of transcription factor binding, and in time is greatly shortened to identify transcription factor staining In the conservative sequence of the time required to provide a good prerequisite for the timely expression of specific genes under oxidative stress; (2) OGG1 repair proteins can also affect NF- kappa B regulated gene promoter activity, which directly regulates gene transcription levels; (3) ROS not only oxidative attack DNA, oxidative base damage, protein will be oxidized, cysteine OGG1 protein is due to oxidation of base excision activity was inhibited, integrity of the genome may provide for transcription; (4) there is damage to the base and DNA repair enzyme can specifically regulate gene expression, in a certain period of time and space that is the interaction between the DNA damage and transcriptional regulation; (5) the molecular mechanism and molecular effects of OGG1 repair proteins in transcriptional regulation of NF- kappa B starting in promoting gene expression. The study reveals a new mechanism of DNA damage repair enzymes OGG1 transcription activation, with OGG1 oxidative damage recognition starting sub area can promote and accelerate the production of 8-oxoG NF- kappa B and DNA, which helps to show gene; tissue, cells subjected to pathogen, environmental factors of the invasion of ROS the rapid increase of proinflammatory cytokines required for innate immune response, chemokine expression is highly dependent on the ROS signal, and this kind of gene promoter is high GC content, and contains a number of NF- B binding site, oxidative damage to organism response is an innate immune defense mechanism is very important. Our study shows that, with the important function of transcriptional response in the specific time and space on the traditional concept of DNA damage; oxidative stress conditions, the mechanism of OGG1 damage recognition may become the premise of define specific regulation of NF- kappa B transcription .

【學位授予單位】：東北師范大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：Q78

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本文編號：1666909