發(fā)布時(shí)間：2018-03-23 14:36

  本文選題：SIRT3　切入點(diǎn)：神經(jīng)干細(xì)胞　出處：《南方醫(yī)科大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：研究背景神經(jīng)干細(xì)胞(NSC),特別是成體神經(jīng)干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)為哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)再生修復(fù)帶來新的希望。神經(jīng)再生貫穿整個(gè)生命過程,哺乳動(dòng)物大腦每天產(chǎn)生數(shù)以千計(jì)的新神經(jīng)元。NSC增殖、分化、凋亡等生命活動(dòng)受到其周圍復(fù)雜微環(huán)境信號(hào)的調(diào)控。海馬神經(jīng)再生障礙與神經(jīng)退行性疾病發(fā)生的微環(huán)境改變有關(guān),這些疾病包括老年認(rèn)知功能障礙、阿爾茨海默病(AD)等。小膠質(zhì)細(xì)胞激活和促炎因子表達(dá)為神經(jīng)退行性疾病病理特征,激活的小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生多種促炎因子誘發(fā)炎癥和氧化應(yīng)激,如TNF-a,一氧化氮等,ROS誘導(dǎo)炎性反應(yīng)破壞神經(jīng)干細(xì)胞正常生長的微環(huán)境,從而抑制神經(jīng)再生和線粒體功能,高水平ROS還可提升胞內(nèi)Ap淀粉樣蛋白的濃度,導(dǎo)致神經(jīng)元損傷。ROS濃度升高促進(jìn)細(xì)胞死亡、蛋白沉積,從而加速神經(jīng)退行性疾病如AD的進(jìn)展。線粒體在神經(jīng)再生中發(fā)揮至關(guān)重要的作用,神經(jīng)元對(duì)線粒體功能障礙特別敏感,線粒體保護(hù)和體外過表達(dá)抗凋亡蛋白可促進(jìn)神經(jīng)分化、增強(qiáng)動(dòng)物大腦受損部位神經(jīng)前體細(xì)胞的生存能力。Sirtuin3(SIRT3)屬于Sirtuin基因家族成員,主要定位于線粒體,具有去乙�；富钚�。SIRT3具有多種生物功能,參與調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激、能量代謝、ATP生成、ROS清除、線粒體功能等,在神經(jīng)退行性、糖尿病、衰老、癌癥等疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。衰老大鼠模型中樞聽覺皮層SIRT3、SOD2表達(dá)減少,AD鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元SIRT3表達(dá)水平也顯著下降。神經(jīng)元SIRT3基因缺失增加H202誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激死亡,SIRT3基因缺失還加劇PD模型小鼠黑質(zhì)紋狀體多巴胺能神經(jīng)元的退化。SIRT3在神經(jīng)疾病發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮一定作用,但尚未見神經(jīng)干細(xì)胞SIRT3與神經(jīng)再生的相關(guān)研究報(bào)道。課題組前期研究證實(shí)小膠質(zhì)細(xì)胞激活產(chǎn)生的炎性損傷誘導(dǎo)NSC凋亡,抑制其分化為神經(jīng)元,并與能量代謝有關(guān)。在此基礎(chǔ)上,我們推測(cè),SIRT3可能通過減輕氧化應(yīng)激和炎癥損傷、改善線粒體功能等,在小膠質(zhì)細(xì)胞激活致NSC失能過程中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用,促進(jìn)神經(jīng)再生。本課題研究可望為揭示神經(jīng)炎癥介導(dǎo)NSC失能的機(jī)制提供新觀點(diǎn),為AD等神經(jīng)退行性疾病臨床治療和藥物干預(yù)提供新靶點(diǎn)。目的研究SIRT3在小膠質(zhì)細(xì)胞激活致NSC失能中的作用,探討SIRT3基因過表達(dá)和干擾對(duì)NSC凋亡、增殖、分化、線粒體功能、ROS生成等生命活動(dòng)的影響及相關(guān)分子機(jī)制。方法本研究采用Tanswell系統(tǒng)共培養(yǎng)小鼠神經(jīng)干細(xì)胞系C17.2(NSC)和小膠質(zhì)細(xì)胞BV-2(MG),C17.2細(xì)胞貼壁培養(yǎng)在下室,BV-2貼壁培養(yǎng)在上室。共培養(yǎng)系統(tǒng)中添加10 μM Aβ作用于兩種細(xì)胞,BV-2細(xì)胞被激活,建立小膠質(zhì)細(xì)胞激活致神經(jīng)干細(xì)胞失能的細(xì)胞共培養(yǎng)模型。SIRT3基因過表達(dá)和干擾模型的建立：C17.2細(xì)胞與BV-2細(xì)胞共培養(yǎng)前,C17.2接種在細(xì)胞培養(yǎng)六孔板的底部,當(dāng)匯合度約為40%～60%時(shí),過表達(dá)模型添加SIRT3過表達(dá)腺病毒,干擾模型添加SIRT3-siRNA,細(xì)胞均無血清培養(yǎng)轉(zhuǎn)染6h；而BV-2細(xì)胞接種在另一個(gè)嵌套有Transwell裝置六孔板的上室底部,使BV-2細(xì)胞匯合度在C17.2細(xì)胞病毒或siRNA轉(zhuǎn)染完時(shí)達(dá)到50%～60%左右；當(dāng)C17.2轉(zhuǎn)染完后,將貼壁培養(yǎng)BV-2細(xì)胞的Transwell嵌套裝置移至底部貼壁培養(yǎng)有C17.2細(xì)胞的六孔板中,并添加10 μM Aβ作用于BV-2和C17.2細(xì)胞。利用細(xì)胞免疫熒光技術(shù)鑒定C17.2-NSC標(biāo)記物nestin、并檢測(cè)SIRT3的蛋白表達(dá)。采用ELISA和分光光度法檢測(cè)共培養(yǎng)系統(tǒng)細(xì)胞培養(yǎng)液中炎性因子TNF-α、 IL-1β、IL-6和NO的濃度。使用DHE熒光探針法檢測(cè)NSC細(xì)胞裂解液中超氧陰離子的水平。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡與細(xì)胞周期分布。使用JC-1法檢測(cè)線粒體膜電位的變化,采用酯化鈣黃綠素(Calcein-AM)與氯化鈷(CoCl2)共孵育法分析線粒體膜通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔的開放情況。采用qRT-PCR檢測(cè)相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平,PCR產(chǎn)物進(jìn)行DNA瓊脂糖凝膠電泳。利用ELISA檢測(cè)NSC胞內(nèi)caspase-3、caspase-9的活性大小。采用Western blotting檢測(cè)相關(guān)基因蛋白表達(dá)水平,條帶灰度掃描后進(jìn)行半定量分析。結(jié)果1、小膠質(zhì)細(xì)胞激活對(duì)NSC功能及SIRT3表達(dá)的影響SIRT3在NSC中表達(dá)和神經(jīng)再生中的功能研究目前未見報(bào)道。試驗(yàn)分為C17.2單獨(dú)培養(yǎng)組(NSC組)、小膠質(zhì)細(xì)胞BV-2和C17.2共培養(yǎng)組(MG+NSC組)、Aβ作用于C17.2組(Aβ+NSC組)、Ap作用于共培養(yǎng)的BV-2和C17.2細(xì)胞模型組(Aβ+MG+NSC組)。通過研究,我們發(fā)現(xiàn)：NSC-C17.2可表達(dá)SIRT3,且主要定位于細(xì)胞核外。小膠質(zhì)細(xì)胞激活下調(diào)NSC SIRT3、MnSOD的表達(dá)水平,Aβ+MG+NSC組NSC SIRT3與Mn-SOD蛋白表達(dá)水平顯著低于Aβ+NSC組,兩者mRNA表達(dá)水平也顯著降低(P=0.000,P=0.003)。Ap激活小膠質(zhì)細(xì)胞分泌炎性因子和NO, NSC胞內(nèi)ROS水平升高,誘發(fā)氧化應(yīng)激。表現(xiàn)為：與Aβ+NSC組比較,Aβ+MG+NSC組細(xì)胞培養(yǎng)液中炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6和NO濃度顯著增大(P=0.000,P=0.002,P=0.012,P=0.000),且NSC細(xì)胞裂解液中超氧陰離子、過氧化氫水平顯著升高(P=0.000,P=0.000)。AP+MG+NSC組NSC細(xì)胞凋亡率明顯增大(P=0.000), NSC G0/G1細(xì)胞數(shù)量明顯增多(P=0.000),S期、G2/M期細(xì)胞比例顯著減少(P=0.000,P=0.002)。Aβ+MG+NSC組NSC JC-1紅色／綠色熒光強(qiáng)度比值顯著變小(P=0.003),Calcein-AM綠色熒光強(qiáng)度顯著減弱(P=0.034)。2、NSC SIRT3在小膠質(zhì)細(xì)胞激活致NSC損傷中的作用從過表達(dá)和干擾SIRT3正反兩方面研究NSC SIRT3在小膠質(zhì)細(xì)胞激活致NSC損傷中的作用。過表達(dá)組分為Control空白對(duì)照組、Vector空載體腺病毒轉(zhuǎn)染組、SIRT3過表達(dá)腺病毒轉(zhuǎn)染組；干擾組分為Control空白對(duì)照組、Scrambled siRNA陰性對(duì)照組、siSIRT3干擾組。過表達(dá)組結(jié)果顯示,SIRT3過表達(dá)組NSC SIRT3、Mn-SOD mRNA表達(dá)水平顯著高于Control組(P=0.000,P=0.000),約為Control組表達(dá)水平的8倍左右,SIRT3、Mn-SOD蛋白表達(dá)也顯著上調(diào)。與Control組比較,SIRT3過表達(dá)組NSC DHE紅色熒光強(qiáng)度減弱、超氧陰離子水平顯著降低(P=0.009),過氧化氫濃度明顯減小(P=0.008)。與Control組比較,SIRT3過表達(dá)組NSC細(xì)胞凋亡率顯著減小(P=0.003),G0/G1期細(xì)胞所占比例顯著減小(P=0.005),S、G2/M期細(xì)胞所占比例顯著增大(P=0.004,P=0.013)。SIRT3過表達(dá)組NSCJC-1紅/綠熒光強(qiáng)度比值顯著大于Control組(P=0.004)。與Control組比較,SIRT3過表達(dá)組NSC線粒體CypD蛋白表達(dá)明顯減少,Calcein-AM綠色熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)(P=0.006)。與Control組比較,SIRT3過表達(dá)組線粒體Cyt C釋放到胞漿明顯減少,促凋亡因子cleaved caspase-3、Bax蛋白表達(dá)明顯下調(diào),凋亡抑制因子Bcl-2蛋白表達(dá)明顯增多,caspase-3、caspase-9酶活性均顯著減弱(P=0.012,P=0.022)。干擾組結(jié)果表明,siSIRT3干擾組NSC SIRT3、Mn-SOD mRNA表達(dá)水平顯著低于Control組(P=0.000,P=0.000),約為Control組水平的26%左右,SIRT3、 Mn-SOD蛋白表達(dá)也顯著減少。siSIRT3干擾組NSC超氧陰離子、過氧化氫濃度顯著大于Control組(P=0.003,P=0.006)。與Control組比較,siSIRT3干擾組細(xì)胞凋亡率明顯升高(P=0.001),G0/G1期細(xì)胞所占比例顯著增大(P=0.012),S期細(xì)胞所占比例顯著減小(P=0.003)。與Control組比較,siSIRT3干擾組NSCJC-1紅/綠熒光強(qiáng)度比值顯著變小(P=0.001),Calcein-AM綠色熒光強(qiáng)度明顯減弱(P=0.013),線粒體CypD蛋白表達(dá)增多。與Control組比較,siSIRT3干擾組線粒體Cyt C釋放到胞漿明顯增多,促凋亡因子cleaved caspase-3、Bax蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào),凋亡抑制因子Bcl-2蛋白表達(dá)明顯減少,caspase-3、 caspase-9活性顯著增強(qiáng)(P=0.001,P=0.011)。正反兩方面結(jié)果證實(shí),NSC SIRT3可上調(diào)MnSOD表達(dá),顯著降低胞內(nèi)ROS水平,抑制NSC凋亡,促進(jìn)細(xì)胞分裂,使線粒體膜電位上升,減少線粒體膜通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔開放及CypD蛋白表達(dá)；SIRT3表達(dá)抵抗小膠質(zhì)細(xì)胞激活致NSC失能的作用機(jī)制,與線粒體Cyt C釋放到胞漿減少,Bax表達(dá)減少,Mn-SOD、Bcl-2表達(dá)上調(diào),及caspase-3/9活性受到抑制有關(guān)。3、SIRT3對(duì)NSC分化的影響及相關(guān)機(jī)制小膠質(zhì)細(xì)胞激活產(chǎn)生氧化應(yīng)激與炎癥破壞腦內(nèi)微環(huán)境,影響成年神經(jīng)再生,SIRT3可抵抗小膠質(zhì)細(xì)胞激活對(duì)NSC產(chǎn)生的損害。采用過表達(dá)腺病毒和siRNA轉(zhuǎn)染共培養(yǎng)模型中NSC,探討SIRT3對(duì)全反式維甲酸誘導(dǎo)C17.2-NSC分化的影響及相關(guān)分子機(jī)制。試驗(yàn)分為NSC組、Control模型組、SIRT3過表達(dá)組、siSIRT3干擾組,各組均添加1μM維甲酸誘導(dǎo)NSC分化48 h。結(jié)果顯示,與Control模型組比較,SIRT3過表達(dá)組NSC NeuN、MAP-2 mRNA表達(dá)水平明顯上調(diào)(P=0.002,P=0.001),而nestin和GFAP mRNA表達(dá)明顯減少(P=0.001,P=0.000),siSIRT3干擾組NSC NeuN、MAP-2 mRNA表達(dá)水平則顯著降低(P=0.001, P=0.000), nestin和GFAP mRNA表達(dá)水平則明顯升高(P=0.003, P=0.005), Western blotting結(jié)果顯示,各組蛋白表達(dá)與mRNA水平變化趨勢(shì)一致。與Control模型組比較,SIRT3過表達(dá)組NSC β=catenin、 p-GSK-3β蛋白表達(dá)明顯增加(P=0.001,P-0.001), p-β-catenin、GSK-3β、Axin2表達(dá)明顯下調(diào)(P=0.001,P=0.026,P=0.000),siSIRT3干擾組NSC β-catenin、 p-GSK-3p蛋白表達(dá)則顯著減少(P=0.006,P=0.000),p-β-catenin、GSK-3β、 Axin2表達(dá)顯著上調(diào)(P=0.020,P=0.000,P=0.000)。結(jié)果說明,SIRT3過表達(dá)誘導(dǎo)共培養(yǎng)系統(tǒng)NSC向神經(jīng)元分化,當(dāng)SIRT3干擾后,NSC向神經(jīng)元分化減少,轉(zhuǎn)而分化為膠質(zhì)細(xì)胞。SIRT3促進(jìn)NSC分化為神經(jīng)元,與Wnt/β-catenin信號(hào)通路有關(guān),是通過上調(diào)β-catenin、p-GSK-3β表達(dá),下調(diào)p-β-catenin、GSK-3β、Axin2表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。結(jié)論(1)Aβ激活小膠質(zhì)細(xì)胞誘發(fā)共培養(yǎng)NSC氧化應(yīng)激和炎性損傷,并下調(diào)NSCSIRT3基因表達(dá)；(2) NSC SIRT3可緩解小膠質(zhì)細(xì)胞激活誘發(fā)的NSC損傷,抑制細(xì)胞凋亡,促進(jìn)細(xì)胞分裂,改善線粒體功能；(3) NSC SIRT3抵抗小膠質(zhì)細(xì)胞激活致NSC失能的作用機(jī)制,與減少線粒體膜通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔開放及CypD表達(dá),抑制線粒體Cyt C向胞漿釋放、減小Bax/Bcl-2比值、降低caspase-3/caspase-9活性有關(guān)；(4) SIRT3促進(jìn)NSC向神經(jīng)元分化,Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活介導(dǎo)此過程；(5)研究結(jié)果可為NSC生存微環(huán)境的改善提供新認(rèn)識(shí),為AD等神經(jīng)退行性疾病的防治提供新靶點(diǎn)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R338

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本文編號(hào)：1653890