本文選題：樹干畢赤酵母　切入點：木質(zhì)纖維素　出處：《四川農(nóng)業(yè)大學》2016年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：木質(zhì)纖維素,因其具有可再生性、價格低廉以及來源廣泛等諸多優(yōu)點,被認為是燃料乙醇生產(chǎn)的最佳原料。然而,所有的發(fā)酵微生物均不能直接有效地發(fā)酵木質(zhì)纖維素生成乙醇,必須在發(fā)酵前進行預處理。在此過程中,不可避免地會產(chǎn)生對發(fā)酵微生物有強烈抑制作用的有毒副產(chǎn)物,即抑制因子。在眾多的抑制因子中,醛類是最為關(guān)鍵的抑制因子。與天然的發(fā)酵微生物釀酒酵母相比,樹干畢赤酵母不僅能發(fā)酵木質(zhì)纖維素水解產(chǎn)物中的五碳糖,而且還能分泌多種能降解木質(zhì)纖維素的水解酶。因此,該酵母菌被認為是較為理想的木質(zhì)纖維素乙醇發(fā)酵微生物。人們已對釀酒酵母中與醛類脫毒相關(guān)的酶基因進行了較為深入的研究,而對樹干畢赤酵母的研究還未見報道。由于這兩種酵母菌在分類上存在較遠的親緣關(guān)系,必須對樹干畢赤酵母中與醛類脫毒相關(guān)的酶基因單獨開展研究。本論文以樹干畢赤酵母(Scheffersomyces stipites)模式菌株CBS 6054為實驗材料,借鑒釀酒酵母研究中的結(jié)果,選擇了樹干畢赤酵母基因組中3個基因家族SsADH、SsAAD、SsALD以及1個單獨SsGRE2基因作為目的基因,開展了這些基因?qū)﹃P(guān)鍵醛類抑制因子糠醛和5-羥甲基糠醛的轉(zhuǎn)錄應(yīng)答分析。然后將這些基因分別在釀酒酵母中進行過量表達及表達蛋白的功能分析,同時開展了編碼蛋白的氨基酸序列分析,獲得實驗結(jié)果如下：(1)通過細胞生長實驗的比較分析,發(fā)現(xiàn)樹干畢赤酵母的生長在初期會受到糠醛或5-羥甲基糠醛的抑制,經(jīng)過一段時間的遲滯期后又會重新恢復細胞生長。采用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)技術(shù),我們開展了樹干畢赤酵母中3個基因家族SsADH、SsAAD、SsALD以及1個單獨SsGRE2基因共20個目的基因在遲滯期內(nèi)對糠醛或5-羥甲基糠醛應(yīng)激條件下轉(zhuǎn)錄變化的絕對定量分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在SsADH家族的7個基因中,SsADH4和SsADH6的轉(zhuǎn)錄水平在糠醛和5-羥甲基糠醛應(yīng)激條件下均有了顯著提高,轉(zhuǎn)錄數(shù)量最高上調(diào)了150倍。在SsAAD家族的5個基因中,SsAAD3在糠醛和5-羥甲基糠醛應(yīng)激條件下均顯著提高,轉(zhuǎn)錄數(shù)量最高上調(diào)8倍。SsGRE2在糠醛和5-羥甲基糠醛應(yīng)激條件下均顯著提高,轉(zhuǎn)錄數(shù)量最高上調(diào)了26.5倍。在SsALD家族的7個基因中,SsALD6在糠醛應(yīng)激條件下轉(zhuǎn)錄數(shù)量上調(diào)了5.5倍,SsALD3在5-羥甲基糠醛應(yīng)激條件下表達量上調(diào)1.5倍。其它基因的表達量在這兩種醛應(yīng)激條件下無明顯上調(diào),有的甚至出現(xiàn)下降。(2)采用PCR技術(shù)擴增獲得了20個目的基因的編碼序列,分別構(gòu)建了重組穿梭質(zhì)粒,并且在釀酒酵母實驗菌株中獲得了成功表達。表達蛋白的酶學性質(zhì)研究發(fā)現(xiàn),在SsADH家族中,SsAdh4p、SsAdh5p、SsAdh6p以及SsAdh7p可同時以NADH和NADPH為輔酶對糠醛有活性,而SsAdh1p只能以NADH為輔酶對糠醛有活性。SsAdh4p、SsAdh5p、SsAdh6p以及SsAdh7p只能以NADPH為輔酶對5-羥甲基糠醛有活性。這些酶催化反應(yīng)的最適pH均為6.0,最適溫度均為30℃。在以NADH為輔酶時,SsAdh7p對糠醛的親和力最強(Km,1.94±0.02 mM)；而在以NADPH為輔酶時,SsAdh4p對糠醛和5-羥甲基糠醛催化的親和力最強(Km,0.24±0.02mM和0.26±0.03 mM)。在SsAAD家族中,所有的5個編碼蛋白均能以NADH為輔酶對糠醛有活性,而僅有SsAad2p在以NADPH為輔酶時對5-羥甲基糠醛有活性。所有蛋白催化糠醛和5-羥甲基糠醛反應(yīng)的最適pH值在6.0-7.0之間,適溫度在30℃左右。在以NADH為輔酶時,SsAad4p對糠醛的親和力最強(Km,3.24±0.03 mM),但SsAad5p對糠醛的催化效率最高(Kcat/Km,78.51±1.82 mM-1 min-1)。SsGre2p能利用兩種輔酶對糠醛表現(xiàn)出活性,但僅能利用NADPH為輔酶對5-羥甲基糠醛表現(xiàn)出活性。以NADH為輔酶催化糠醛反應(yīng)時的最適pH值為6.0,以NADPH為輔酶催化糠醛和5-羥甲基糠醛反應(yīng)時的最適pH值均為7.0。以NADH和NADPH為輔酶還原糠醛時的最適溫度均為20 ℃,但以NADPH為輔酶還原5-羥甲基糠醛時的最適溫度則為40 ℃。在以NADH為輔酶情況下,SsGre2p對糠醛的親和力最強(Km,0.36 mM)。在SsALD家族中,無論是以糠醛還是5-羥甲基糠醛為底物,在兩種輔酶的作用下所有目的蛋白均表現(xiàn)出較弱的催化活性。(3)以其它9種醛類(大部分為木質(zhì)纖維素水解液中的醛類因子)為底物的酶活實驗研究發(fā)現(xiàn),在SsADH家族中,大多數(shù)蛋白對大部分的供試醛表現(xiàn)出活性。SsAdh1p在以NADH為輔酶時對乙醛的活性最高(883.07±8.23 U/mg)。在SsAAD家族中,SsAad2p和SsAad3p在以NADH為輔酶時對7種以上的醛表現(xiàn)出活性。而SsAad4p則在以NADPH為輔酶時對6種醛表現(xiàn)出活性。其中SsAad2p在以NADH為輔酶時對乙醛的活性最高(208.45±5.36 U/mg)。SsGre2p對所有的供試醛類都表現(xiàn)出活性。在以NADPH為輔酶時對苯乙醛的活性最高(25.72±0.29 U/mg)。在SsALD家族中,SsAld1p、SsAld4p和SsAad7p對供試醛類的活性較為廣泛。其中SsAld1p在以NADH為輔酶時對乙醛的活性最高(112.83±4.02 U/mg)。(4)目的蛋白的氨基酸序列分析結(jié)果顯示,SsADH家族中的7個蛋白均屬于中鏈脫氫酶(MDR),SsAAD家族中的5個蛋白,除SsAad1p屬于短鏈脫氫酶(SDR)之外,其余蛋白均屬于具有鋅離子結(jié)合位點的中鏈脫氫酶(MDR)。而SsGre2p屬于短鏈脫氫酶(SDR)。同時,在所有的20個目的蛋白氨基酸序列中,發(fā)現(xiàn)了一些相應(yīng)的保守序列。例如,輔酶結(jié)合區(qū)域和催化區(qū)域等。本論文研究從樹干畢赤酵母基因組測序推定的可能編碼醛還原酶基因中,成功鑒定出了對木質(zhì)纖維素水解醛類具有脫毒能力的基因。初步探討了這些基因?qū)啡┖?-羥甲基糠醛的轉(zhuǎn)錄應(yīng)答反應(yīng),較為系統(tǒng)地分析了編碼蛋白的酶學性質(zhì)。通過綜合比較分析,發(fā)現(xiàn)了樹干畢赤酵母中在糠醛和5-羥甲基糠醛脫毒中最為關(guān)鍵的酶基因及參與脫毒的機理。本研究還發(fā)現(xiàn)了一些在其它醇類燃料生產(chǎn)中具有潛力的醛還原酶基因。本論文研究獲得的成果,有助于增加對樹干畢赤酵母對木質(zhì)纖維素水解醛類抑制因于脫毒機制的了解,可為新酶的開發(fā)利用提供借鑒與參考,為樹干畢赤酵母醛類抑制因子耐受的育種改造提供指導,為推進木質(zhì)纖維素燃料乙醇的工業(yè)化生產(chǎn)做出貢獻。
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【學位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：TS261.1;Q78

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 武小芬;陳亮;陳靜萍;蘇小軍;王克勤;;木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)轉(zhuǎn)化為燃料乙醇關(guān)鍵技術(shù)研究現(xiàn)狀[J];湖南農(nóng)業(yè)科學;2013年23期

2 李科;靳艷玲;甘明哲;劉曉風;趙海;;木質(zhì)纖維素生產(chǎn)燃料乙醇的關(guān)鍵技術(shù)研究現(xiàn)狀[J];應(yīng)用與環(huán)境生物學報;2008年06期

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本文編號：1624337