本文選題：Bacillus　切入點：mycoides　出處：《甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：微生物資源是寶貴的戰(zhàn)略性生物資源,是新時代世界各國都優(yōu)先發(fā)展的方向之一。PGPR菌因其卓越的促生性能和綠色安全的環(huán)境親和力,近些年來廣受學(xué)術(shù)界的關(guān)注,目前的研究大多是針對PGPR的促生性能展開的,很少有深入其分子機理的研究,因此,PGPR的促生分子機理是怎樣的?其代謝調(diào)控規(guī)律如何?發(fā)揮促生作用的基因有哪些?這些問題目前還沒有答案,對這些問題的研究和回答,不僅有助于揭示PGPR菌促生的分子機理,而且有利于更好的利用PGPR菌株,造福農(nóng)業(yè)發(fā)展。本課題組前期研究中分離出一株優(yōu)良的PGPR,編號為Gnyt1。發(fā)現(xiàn)其性能十分突出,具有深入研究的科學(xué)價值和工業(yè)化開發(fā)的潛力,鑒于此本研究對該菌株的特性和機理進行了深入的研究。以Gnyt1菌株為材料,系統(tǒng)研究了其促生特性、生物學(xué)特性以及菌株對植物的影響和對土壤的影響,并對菌株進行了重鑒定。在此基礎(chǔ)上,采用二代和三代測序技術(shù)相結(jié)合的研究體系,對菌株進行全基因組測序,基于全基因組數(shù)據(jù),仔細分析和預(yù)測菌株核基因組和質(zhì)粒基因組中可能存在的功能基因,重點了分析與菌株促生特性有關(guān)的基因。通過上述的研究,得到了以下結(jié)果:(1)針對Gnyt1菌株促生特性的研究表明:Gnyt1菌株具有溶磷、固氮、分泌植物激素等多種功能,其固氮酶活性達3193.07 nmol(C2H4)·h-1·m L-1,能高效的溶解無機磷和有機磷,且能同時分泌IAA、GA3、t-Z等三種植物激素,將其與本課題組前期研究中得到的優(yōu)良菌株進行對比,其功能更為突出;將其與其他研究者所得到的優(yōu)良菌株相比,也有一定的優(yōu)勢。(2)針對Gnyt1菌株生物學(xué)特性的研究表明:Gnyt1菌株與對照菌相比,生長曲線的延滯期短(約4h)、其對數(shù)期增殖速度快、穩(wěn)定期活菌濃度高,適合高密度發(fā)酵;Gnyt1對溫度和pH的耐受性也較好;而耐藥性檢驗的結(jié)果則表明供試菌和對照菌對4種抗生素均沒有耐藥性;供試菌在菌液灌根和葉面接種兩種處理下對青稞、番茄、油菜、當(dāng)歸、苜蓿等五種作物均無致病性。穩(wěn)定性檢驗結(jié)果反應(yīng)供試菌和對照菌在純培養(yǎng)條件下,隨著菌株傳代次數(shù)的增加,其促生能力均呈下降趨勢。(3)針對Gnyt1菌株對植物影響的研究表明:Gnyt1菌株對青稞、番茄、油菜、當(dāng)歸、苜蓿等五種作物的生長和產(chǎn)量都有促進作用,但在不同植物中的作用不同;包括Gnyt1菌株在內(nèi)PGPR還能提高作物的品質(zhì),如提高中藥材當(dāng)歸揮發(fā)油和阿魏酸的含量,提高苜蓿干草中粗蛋白和粗脂肪的含量,降低粗纖維的含量。(4)針對Gnyt1菌株對土壤特性影響的研究表明:使用Gnyt1菌液處理后,土壤的基礎(chǔ)呼吸增加6.3%,土壤誘導(dǎo)呼吸增加19.6%,土壤微生物量碳增加9.8%,土壤代謝熵(qCO_2)降低11.6%。利用PLFA法在本研究的土樣中共檢測出17種磷脂脂肪酸,促生菌劑的使用可以增加總PLFA的量。使用促生菌劑后,土壤細菌的量增加,真菌的量減少,微生物壓力指數(shù)降低。從固氮菌群的角度進行的研究得出:使用PGPR菌劑后,土壤好氣性自生固氮菌的量增加11.2%~31%,土壤嫌氣性自生固氮菌的數(shù)量增加4.2%~7.6%,,土壤中nifH基因相對含量也有不同程度的增加。(5)對Gnyt1菌株的鑒定結(jié)果顯示:Gnyt1菌株的生理生化特性與Bacillus mycoides的生理生化特征的吻合度為100%,通過在Genbank數(shù)據(jù)庫中進行BLAST比對并結(jié)合表型特征的觀察結(jié)果、生理生化特性的分析以及16Sr DNA序列分析的結(jié)果,最終可以確定Gnyt1菌株為Bacillus mycoides,將其提交保存至中國典型培養(yǎng)物中心,獲得保藏號為CCTCC M 2017177。(6)對Bacillus mycoides Gnyt1菌株的全基因組測序并分析發(fā)現(xiàn)1)用CTAB法提取的DNA質(zhì)量和濃度都較高,符合測序文庫的構(gòu)建要求;用二代測序和三代測序相結(jié)合的方法測其全基因組序列,分別構(gòu)建測序文庫。二代測序Reads總數(shù)為3,025,470條;堿基總數(shù)742,832,445條;模糊堿基的比例為0.001%,總堿基的GC百分含量為38.8%;堿基識別準(zhǔn)確率在99%以上的堿基所占百分比為76.2%;堿基識別準(zhǔn)確率在99.9%以上的堿基所占百分比為64.4%。2)序列經(jīng)過過濾后,單堿基質(zhì)量很高;Base content分布分析顯示GC和AT含量匹配性較好;GC content分布顯示理論分布與實際分布的一致性較好;Sequence base quality檢驗得知本次測序的峰值在Q37左右;二代測序結(jié)果高質(zhì)量reads2217564條,高質(zhì)量reads堿基數(shù)高達471,926,886 bp;三代測序結(jié)果其測的的序列長度大,沒有不確定堿基。基因組序列拼接后序列的總長度為5,597,907 bp,GC百分含量為35.57%;ORF預(yù)測發(fā)現(xiàn)共有ORF 5,876個;nc RNA的預(yù)測顯示共有t RNA和r RNA兩大類nc RNA;未發(fā)現(xiàn)CRISPRs的存在;prophage預(yù)測的結(jié)果顯示在該菌株基因組中共有9個原噬菌體,其中3號、5號、6號等3個為不完整的原噬菌體,而其余的6個為完整的原噬菌體;GIs預(yù)測結(jié)果顯示該菌株核基因組中共有23個GIs;VFDB分析共發(fā)現(xiàn)了10個毒力基因,分別是clpC、clpP、htpB、galE、nheA、nheB、hblC、inhA、lplA1、icl等;CARD發(fā)現(xiàn)與抗生素耐藥性有關(guān)基因有51條,與抗生素靶基因有關(guān)的基因有27條,與抗生素合成有關(guān)的基因有4條;對其產(chǎn)抗生素的基因深入分析發(fā)現(xiàn)該菌株有Bacitracin(抗菌肽)合成基因;CAZy分析基因組中糖苷水解酶類的基因有30條,糖基轉(zhuǎn)移酶類的基因有36條,碳水化合物酯酶類的基因有38條,輔助活性酶類基因有6條,碳水化合物結(jié)合相關(guān)的酶類基因有19條,其余與碳水化合物相關(guān)的酶基因有15條,不含多糖裂解酶;信號肽(signal peptides)預(yù)測顯示菌株核基因組序列中有348條蛋白編碼基因中存在信號肽序列;跨膜螺旋結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示出菌株核基因組序列總共有1,601條編碼蛋白質(zhì)的基因,這些基因中存在跨膜螺旋區(qū)域,其占總編碼蛋白質(zhì)基因數(shù)量的27.25%。3)Bacillus mycoides Gnyt1菌株核基因組GOSlim注釋顯示該基因組中以與biological process相關(guān)的基因種類和數(shù)量最多,其次是與molecular function相關(guān)的基因,而與cellular component相關(guān)的基因數(shù)量和種類均最少;COG分類注釋將全部編碼蛋白質(zhì)的基因分為了25類,其中除了Not in egg NOG類外,基因數(shù)目最多的是General function prediction only,數(shù)量高達609條;Swiss-Prot注釋共獲知了2987條基因的信息。本研究最終構(gòu)建了Bacillus mycoides Gnyt1菌株基因組的圈圖,其基因組大小為5,597,907bp大小。(7)對Bacillus mycoides Gnyt1菌株質(zhì)�；蚪M的研究發(fā)現(xiàn)1)質(zhì)粒DNA的瓊脂糖凝膠電泳有多個條帶,質(zhì)粒DNA提取的質(zhì)量和濃度都較高。根據(jù)拼接結(jié)果,在Gnyt1菌株中,共有8個質(zhì)粒,其中1號質(zhì)粒長度為460,379bp;2號質(zhì)粒長度為114,265 bp;3號質(zhì)粒長度為102,550 bp;4號質(zhì)粒長度為82,671bp;5號質(zhì)粒長度為73,408 bp;6號質(zhì)粒長度為64,682 bp;7號質(zhì)粒長度為51,563bp;8號質(zhì)粒長度為10,665 bp。2)ncRNA預(yù)測在plasmid1中發(fā)現(xiàn)了ncRNA,其中tRNA基因1條,其他ncRNA基因18條,其余質(zhì)粒中均未發(fā)現(xiàn)ncRNA;菌株plasmid基因組中,未發(fā)現(xiàn)CRISPRs的存在;在Plasmid1、Plasmid2、Plasmid3、Plasmid4、Plasmid6和Plasmid7等6個質(zhì)粒中預(yù)測出有原噬菌體基因存在,其中Plasmid1種發(fā)現(xiàn)有兩條不完整原噬菌體基因,Plasmid2、Plasmid3、Plasmid4中各存在一條不完整原噬菌體基因,Plasmid6中存在兩條原噬菌體基因,一條是完整的噬菌體基因,另一條是不完整的噬菌體基因。GIs(基因島)預(yù)測顯示在Plasmid1基因組中,一共存在5處基因島;在Plasmid2基因組中,只存在1處基因島。在Plasmid5基因組中,存在2處基因島,其余的質(zhì)粒中均未發(fā)現(xiàn)基因島。在Plasmid 1中,發(fā)現(xiàn)有毒力因子nhe B基因和nhe C基因的存在,其余的質(zhì)粒基因組中均未檢測出VFDB;CARD分析顯示在Plasmid 1中,存在2條與抗生素耐藥性有關(guān)的基因,在其他質(zhì)粒中均未檢出與抗生素相關(guān)的基因;CAZy分析分析結(jié)果,在發(fā)現(xiàn)的8個質(zhì)粒中,僅plasmid1、plasmid3和plasmid4上帶有與碳水化合物活性酶相關(guān)的基因。signal peptides的預(yù)測顯示不同plasmid中信號肽序列的數(shù)量不同。跨膜結(jié)構(gòu)的預(yù)測顯示在plasmid中存在數(shù)量不等的跨膜螺旋結(jié)構(gòu)。3)通過GO分析,本研究的8個質(zhì)粒上存在有多種功能的基因,主要以質(zhì)粒的復(fù)制相關(guān)基因為主,不同的質(zhì)粒上所含的功能基因數(shù)量不同,其中以plasmid1最高,以plasmi8最為簡單。8個質(zhì)粒的共同點是與氮代謝相關(guān)的基因數(shù)目及與DNA結(jié)合相關(guān)的基因數(shù)量最多,高于其他功能基因。通過egg NOG分析,本研究的8個質(zhì)粒上存在有多種egg NOG,主要以質(zhì)粒的復(fù)制相關(guān)基因為主,不同的質(zhì)粒上所含的功能基因數(shù)量不同,其中以plasmid1的egg NOG數(shù)目最多,有18類;以plasmi8最為少,僅有1類,最終構(gòu)建了8個質(zhì)粒的基因組圈圖。(8)針對Bacillus mycoides Gnyt1菌株中與促生有關(guān)的基因的分析表明:在供試菌株中,與溶磷性能有關(guān)的基因較多,有pyruvate、malate、acetate、citrate、butyrate、Shikimic等有機酸產(chǎn)生的相關(guān)基因,與上述酸產(chǎn)生的代謝途徑多達14種;與鐵載體分泌有關(guān)的基因主要是存在于Porphyrin metabolism途徑和ABC transporters途徑,共有9條基因與鐵載體的分泌有關(guān);在Gnyt1中,發(fā)現(xiàn)有與桿菌肽分泌有關(guān)的基因主要有兩條,其功能都是acitracin transport system ATP-binding protein,但是在不同的代謝途徑中發(fā)現(xiàn)的。上述研究工作填補了在促生菌功能基因研究方面的空白,具有重要的科學(xué)意義,同時,研究工作也為進一步合理利用促生菌資源提供了理論指導(dǎo)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：Q93

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 康月茜;盧楠;孫菱;李岱容;楊春;;分枝桿菌表達質(zhì)粒的快速構(gòu)建及ClpC2基因功能初步研究[J];免疫學(xué)雜志;2016年02期

2 方精云;白永飛;李凌浩;蔣高明;黃建輝;黃振英;張文浩;高樹琴;;我國草原牧區(qū)可持續(xù)發(fā)展的科學(xué)基礎(chǔ)與實踐[J];科學(xué)通報;2016年02期

3 張武;楊琳;王紫娟;;生物固氮的研究進展及發(fā)展趨勢[J];云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué));2015年05期

4 張義;程曉;王全龍;劉淑杰;吳秉奇;;芡實根際促生細菌的篩選及其生物學(xué)特性[J];山東農(nóng)業(yè)科學(xué);2015年08期

5 盧虎;姚拓;李建宏;馬文彬;柴曉虹;;高寒地區(qū)不同退化草地植被和土壤微生物特性及其相關(guān)性研究[J];草業(yè)學(xué)報;2015年05期

6 馬文彬;姚拓;榮良燕;王國基;孫廣正;劉歡;;無外源氮素條件下接種促生菌對箭{H豌豆生長及根系特性影響[J];草地學(xué)報;2015年03期

7 榮良燕;柴強;姚拓;張榕;馮今;楊浩;曹蕾;朱倩;;復(fù)合微生物接種劑替代部分化肥對豌豆間作玉米的促生效應(yīng)[J];草業(yè)學(xué)報;2015年02期

8 段娜;賈玉奎;徐軍;陳海玲;孫鵬;;植物內(nèi)源激素研究進展[J];中國農(nóng)學(xué)通報;2015年02期

9 譚紅妍;閆瑞瑞;閆玉春;陳寶瑞;辛?xí)云?;不同放牧強度下溫性草甸草原土壤生物性狀及與地上植被的關(guān)系[J];中國農(nóng)業(yè)科學(xué);2014年23期

10 張亮;袁玲;黃建國;;自生固氮菌對土壤鉀的活化作用[J];土壤學(xué)報;2015年02期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 陳華君;張風(fēng)娟;任琴;金幼菊;;植物材料中茉莉酸的提取、純化及其定量方法的研究[A];2005年全國有機質(zhì)譜學(xué)術(shù)交流會論文集[C];2005年

，

本文編號：1610465