本文選題：程序性細胞死亡　切入點：細胞凋亡　出處：《武漢大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：細胞周期和程序性細胞死亡過程涉及發(fā)育、衰老、非生物壓力適應(yīng)、病原體侵染等多個方面,它一直是基礎(chǔ)研究的熱點領(lǐng)域。在動物中,程序性細胞死亡分為細胞凋亡、細胞自噬和細胞壞死。三種不同類型的程序性細胞死亡過程存在明顯的細胞學(xué)和生理生化差異,并且不同類型過程的分子信號通路之間是相互獨立而又密切相關(guān)的。在植物中,目前對程序性細胞死亡過程的分類并不十分清晰,因為各個程序性細胞死亡案例的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)之間差異性很大。因此,不同程序性細胞死亡案例的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)研究可以為區(qū)分不同類型的程序性細胞死亡過程提供依據(jù)。染色質(zhì)修飾是表觀遺傳學(xué)的一個重要分支,它可以通過對染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的調(diào)控來調(diào)節(jié)基因表達。在很多重要的生物學(xué)過程中染色質(zhì)調(diào)控都起著關(guān)鍵性的作用,比如說誘導(dǎo)多能干細胞(iPS)的分化、生殖細胞的形成、種子萌發(fā)、植物逆境反應(yīng)等。盡管如此,在程序性細胞死亡過程中的染色質(zhì)修飾研究至今還是寥寥無幾。對細胞周期和熱介導(dǎo)的程序性細胞死亡過程中染色質(zhì)修飾的功能研究不僅可以揭示各種染色質(zhì)修飾或者染色質(zhì)修飾酶的功能多樣性,而且還能加深人們對細胞周期和程序性細胞死亡過程分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的理解。本論文主要以玉米幼苗為材料研究細胞周期和熱介導(dǎo)的程序性細胞死亡過程中的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、表觀修飾調(diào)控、rDNA調(diào)控,試圖揭示不同程序性細胞死亡過程中染色質(zhì)修飾的功能。本論文包括以下研究內(nèi)容：1.熱壓力誘導(dǎo)的玉米幼苗葉片程序性細胞死亡過程中的組蛋白修飾調(diào)控我們使用DNA ladder和TUNEL實驗檢測到熱壓力誘導(dǎo)玉米幼苗葉片發(fā)生程序性細胞死亡�；钚匝醴肿雍亢拖嚓P(guān)酶酶活檢測結(jié)果顯示,熱處理導(dǎo)致細胞內(nèi)活性氧分子和活性氧相關(guān)酶酶活升高,特別是熱壓力誘導(dǎo)的玉米幼苗葉片程序性細胞死亡過程中超氧負離子含量和活性氧相關(guān)酶酶活明顯升高。活性氧分子積累通常會導(dǎo)致膜系統(tǒng)損傷,細胞膜通透性實驗顯示,活性氧分子造成細胞膜通透性增加。另外,蛋白免疫印跡和熒光免疫染色結(jié)果表明,在熱壓力誘導(dǎo)的玉米幼苗葉片程序性細胞死亡過程中基因組水平組蛋白H3K9、H4K5、H3乙�；�,組蛋白H3K4二甲基化不變,組蛋白H3K9二甲基化降低,同時伴隨著染色質(zhì)脫濃縮。為了研究程序性細胞死亡過程中組蛋白修飾變化和活性氧分子積累之間的關(guān)系,我們使用低濃度表觀修飾抑制劑處理玉米幼苗,觀察玉米幼苗葉片細胞的生理生化和表觀修飾變化。我們使用了兩個組蛋白磷酸化抑制劑H89和AT13148,兩個DNA甲基化抑制劑5-AC和RG108,兩個組蛋白去乙�；种苿㏕SA和CUDC-101。結(jié)果顯示,這些低濃度表觀修飾抑制劑可以導(dǎo)致基因組水平組蛋白H4K5乙酰化升高,并且玉米幼苗葉片細胞阻滯在有絲分裂早前期。進一步的活性氧分子含量和活性氧相關(guān)酶酶活檢測結(jié)果表明,低濃度表觀修飾抑制劑誘導(dǎo)的細胞周期阻滯過程中細胞內(nèi)氧壓升高,于是我們以這個細胞周期阻滯現(xiàn)象為模型研究細胞內(nèi)活性氧水平和表觀修飾變化之間的關(guān)系�？寡趸瘎┝螂蹇梢跃徑獾蜐舛缺碛^修飾抑制劑誘導(dǎo)的細胞周期阻滯過程,這說明活性氧分子調(diào)控這些細胞周期阻滯過程并且表觀修飾變化調(diào)節(jié)細胞內(nèi)活性氧水平。由于低濃度表觀修飾抑制劑只導(dǎo)致基因組水平組蛋白H4K5乙�；�,所以我們使用高濃度組蛋白去乙�；敢种苿㏕SA來更好地模擬基因組水平組蛋白高乙酰化狀態(tài)。高濃度TSA可以導(dǎo)致細胞內(nèi)活性氧水平升高,這說明熱壓力誘導(dǎo)的玉米幼苗葉片程序性細胞死亡過程中很可能是組蛋白修飾變化調(diào)節(jié)細胞內(nèi)活性氧水平。為了研究熱壓力誘導(dǎo)的玉米葉片程序性細胞死亡過程中凋亡相關(guān)基因的表觀修飾調(diào)控,我們使用定量實時PCR和染色質(zhì)免疫共沉淀實驗檢測基因表達和啟動子區(qū)域組蛋白修飾情況。定量實時PCR實驗表明,熱壓力誘導(dǎo)的程序性細胞死亡過程中抑凋亡基因hexokinase表達量降低,促凋亡基因metacaspase type Ⅱ和putative metacaspase表達量升高；同時組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶基因GCN5和HAT-B表達量升高,組蛋白去乙�；富騂DAC101表達量降低。進一步的染色質(zhì)免疫共沉淀實驗證實,組蛋白修飾在hexokinase和putative metacaspase基因表達中起調(diào)控作用。2.熱壓力下的45S rDNA表觀修飾調(diào)控我們使用熒光免疫染色檢測到熱壓力下玉米幼苗葉片細胞核仁裂解的現(xiàn)象,核仁裂解的細胞比例隨著熱處理時間的延長而增加。為了研究熱壓力下核仁裂解的功能,我們使用熒光原位雜交實驗檢測45S rDNA在熱壓力下的變化。熒光原位雜交的結(jié)果顯示,在熱處理1天時45S rDNA脫濃縮細胞比例高于未處理組,在熱處理2天和3天時45S rDNA脫濃縮細胞比例與未處理組沒有差異,在熱處理6天時45S rDNA脫濃縮細胞比例又明顯高于未處理組。熱壓力下核仁和45S rDNA的變化不一樣,這說明它們在熱壓力下的功能存在差異。為了進一步研究45S rDNA在熱壓力下的功能,我們使用定量實時PCR實驗檢測45S rDNA的轉(zhuǎn)錄情況。定量實時PCR結(jié)果表明,在熱處理1天時45S rDNA的ETS和18S區(qū)域轉(zhuǎn)錄量都明顯高于未處理組,這說明熱壓力激活45S rDNA轉(zhuǎn)錄；在熱處理2天和3天時45S rDNA的ETS和18S區(qū)域轉(zhuǎn)錄量都略高于未處理組,這說明熱壓力沒有明顯激活45S rDNA轉(zhuǎn)錄；在熱處理4天后45S rDNA的ETS區(qū)域轉(zhuǎn)錄量遠遠高于未處理組,而45S rDNA的18S區(qū)域轉(zhuǎn)錄量只是略高于未處理組,這說明熱壓力誘導(dǎo)的玉米幼苗葉片程序性細胞死亡過程中45SrDNA轉(zhuǎn)錄起始激活并且轉(zhuǎn)錄延伸受到抑制。45S rDNA轉(zhuǎn)錄情況在熱壓力過程中快速變化,這說明45S rDNA在熱壓力下受到不同形式的調(diào)控。為了研究表觀修飾在45S rDNA轉(zhuǎn)錄調(diào)控中的功能,我們使用質(zhì)譜和染色質(zhì)免疫共沉淀實驗檢測45S rDNA轉(zhuǎn)錄變化過程中啟動子區(qū)域DNA甲基化和組蛋白修飾的變化情況。45S rDNA啟動子區(qū)域DNA甲基化結(jié)果顯示,熱壓力下該區(qū)域各個位點的DNA甲基化情況沒有明顯變化。染色質(zhì)免疫共沉淀實驗顯示,組蛋白修飾在45S rDNA轉(zhuǎn)錄起始過程中起調(diào)控作用,而與熱壓力誘導(dǎo)的玉米幼苗葉片程序性細胞死亡過程中45S rDNA轉(zhuǎn)錄延伸抑制沒有直接關(guān)系。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：Q942.5

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本文編號：1607756