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  本文關(guān)鍵詞：Streptomyces kathirae SC-1黑色素合成關(guān)鍵酶酪氨酸酶基因的克隆表達(dá)及分子改造，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《江南大學(xué)》 2015年

Streptomyces kathirae SC-1黑色素合成關(guān)鍵酶酪氨酸酶基因的克隆表達(dá)及分子改造

郭靜  

【摘要】：黑色素廣泛的存在于動(dòng)植物及微生物中,是由酪氨酸酶催化酪氨酸而生成的一種非均質(zhì)類的多酚聚合物,具有吸收紫外輻射、清除自由基、抗氧化、吸附重金屬離子、清除酚類化合物、作為新型的藥物載體等生理功能,此外,有研究表明黑色素在體外具有抗HIV活性,正是由于黑色素的應(yīng)用價(jià)值使其在醫(yī)藥、化工、農(nóng)藥等方面有廣闊的應(yīng)用前景。雖然黑色素來(lái)源廣泛,但是較低的產(chǎn)量使黑色素的價(jià)格居高不下,進(jìn)而限制其大規(guī)模的應(yīng)用。為此,本論文采用傳統(tǒng)育種的方法,從環(huán)境中篩選獲得了一株黑色素高產(chǎn)菌株,結(jié)合蛋白工程、基因工程、代謝工程等技術(shù)進(jìn)行了一系列有益研究工作:(1)以酪氨酸為底物,從自然界中篩選獲得一株色素高產(chǎn)菌株SC-1,經(jīng)過(guò)紫外、紅外、質(zhì)譜、核磁共振等檢測(cè)手段證明該色素為黑色素,依據(jù)《鏈霉菌鑒定手冊(cè)》的生理生化、培養(yǎng)特征及以16S r RNA序列為基礎(chǔ)的分子生物學(xué)鑒定手段,將菌株SC-1鑒定為S.kathirae。經(jīng)128 h發(fā)酵,黑色素產(chǎn)量為0.8 g·L-1。(2)在搖瓶水平上優(yōu)化Streptomyces kathirae產(chǎn)黑色素發(fā)酵條件,并且采用響應(yīng)面優(yōu)化S.kathirae產(chǎn)黑色素發(fā)酵培養(yǎng)基,確定S.kathirae SC-1產(chǎn)黑色素的最適發(fā)酵條件及最適培養(yǎng)基。培養(yǎng)基(g·L-1):可溶性淀粉4,酵母膏37,Na Cl 5,Ca Cl20.1,Cu SO4·5H2O1.341×10-2;培養(yǎng)條件:初始p H 6.0、溫度28°C、轉(zhuǎn)速200 r·min-1、接種量8%,發(fā)酵時(shí)間128 h。在此條件發(fā)酵,黑色素產(chǎn)量可達(dá)13.7 g·L-1,生產(chǎn)強(qiáng)度為0.11 g·L-1·h-1,較優(yōu)化前提高17.13倍。(3)通過(guò)(NH4)2SO4分級(jí)沉淀、強(qiáng)陰離子交換柱純化獲得S.kathirae酪氨酸酶。SDS-PAGE測(cè)定酪氨酸酶分子量為30 k Da,以左旋多巴為底物測(cè)定酪氨酸酶最適反應(yīng)p H為6.2,最適反應(yīng)溫度為45°C。Co2+、Ni2+和Cu2+對(duì)酪氨酸酶具有抑制作用,但是當(dāng)Cu2+濃度為30μmol·L-1時(shí),對(duì)氨酸酶酶活有促進(jìn)作用,酪氨酸酶酶活可為未添加Cu2+活性的7.2倍。其他金屬離子在一定濃度范圍內(nèi)對(duì)酪氨酸酶酶活具有促進(jìn)作用,作用大小的順序?yàn)锳l3+Mn2+K+Fe3+Na+Zn2+Ba2+Ca2+。硫脲、Tween-80、Triton X-100等添加劑在一定濃度范圍內(nèi)對(duì)酶活有促進(jìn)作用,抗壞血酸、β-巰基乙醇、二硫蘇糖醇、等添加劑對(duì)酶活有強(qiáng)烈抑制作用。以左旋多巴為底物酶動(dòng)力學(xué)常數(shù)Km為0.42 mmol·L-1;Vmax為333.38μmol·mg-1·min-1。(4)以酪氨酸酶部分氨基酸序列為基礎(chǔ),使用TAIL-PCR等分子生物學(xué)手段克隆獲得酪氨酸酶編碼基因及其5’端非編碼序列(553 bp),mel C包含酪氨酸酶金屬伴侶基因mel C1及酪氨酸酶基因mel C2,與以報(bào)道的酪氨酸酶編碼基因的最高同源性為84%。在S.lividans中驗(yàn)證克隆獲得的mel C基因功能,證明只有共表達(dá)酪氨酸酶金屬伴侶與酪氨酸酶才可以得到有活性的酪氨酸酶。同時(shí)通過(guò)啟動(dòng)子缺失實(shí)驗(yàn)在S.lividans中驗(yàn)證上游553 bp功能,證明mel C啟動(dòng)子的有效序列位于-167 bp至-75 bp之間。為提高黑色素產(chǎn)量,在S.kathirae表達(dá)mel C基因使黑色素產(chǎn)量從13.7 g·L-1提高至28.8 g·L-1。(5)在E.coli BL21中使用雙RBS的表達(dá)策略優(yōu)化酪氨酸酶金屬伴侶及酪氨酸酶的表達(dá)量,同時(shí)對(duì)重組大腸桿菌產(chǎn)酪氨酸酶的條件進(jìn)行了優(yōu)化,當(dāng)誘導(dǎo)溫度為16°C、IPTG濃度為0.4 mmol·L-1、誘導(dǎo)時(shí)間為8 h時(shí)重組菌可以較好的生成重組酪氨酸酶。對(duì)重組酪氨酸酶酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究發(fā)現(xiàn)其與野生型酪氨酸酶酶學(xué)性質(zhì)并無(wú)太大區(qū)別。(6)為提高S.kathirae酪氨酸酶穩(wěn)定性,利用SWISS-MODEL以栗色渾圓鏈霉菌(S.castaneoglobisporus)酪氨酸酶(2AHL)為模板對(duì)S.kathirae酪氨酸酶的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行同源模擬,獲得了酪氨酸酶的三維結(jié)構(gòu)。使用在線預(yù)測(cè)軟件Po PMu Si C-2.1計(jì)算酪氨酸酶每個(gè)突變氨基酸的去折疊自由能變化(ΔΔG)來(lái)輔助設(shè)計(jì)提高酪氨酸酶的穩(wěn)定性,確定與酪氨酸酶穩(wěn)定性相關(guān)的關(guān)鍵位點(diǎn),將這些關(guān)鍵位點(diǎn)進(jìn)行相應(yīng)的替換,獲得了熱穩(wěn)定性提高的突變體Q7K、R95Y、G123W、G234P。在此基礎(chǔ)上進(jìn)行組合突變,使酪氨酸酶的熱穩(wěn)定性進(jìn)一步提高,最適溫度提高了10°C、T50提高了10°C,在60、65、70、75°C下的半衰期分別提高了3.52、3.18、3.29、3.14倍。在S.kathirae中表達(dá)酪氨酸酶突變體使黑色素產(chǎn)量進(jìn)一步提高至32.6 g·L-1。

【關(guān)鍵詞】：
【學(xué)位授予單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：Q78;Q936
【目錄】：

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7 王偉;潘志針;胡泳華;劉鳳嬌;楊美花;陳清西;;烷基3,4-二羥基苯酚烷酸酯對(duì)酪氨酸酶的效應(yīng)[A];華東六省一市生物化學(xué)與分子生物學(xué)會(huì)2009年學(xué)術(shù)交流會(huì)論文摘要匯編[C];2009年

8 邱凌;陳良華;鐘雪;明艷林;童慶宣;陳清西;;亞熱帶植物提取物對(duì)酪氨酸酶激活調(diào)控的研究[A];華東六省一市生物化學(xué)與分子生物學(xué)會(huì)2008年學(xué)術(shù)交流會(huì)論文摘要匯編[C];2008年

9 魏海柳;穆燕;姜銳;邱俊;李琳;張喜梅;胡松青;;超聲輔助提取白附子酪氨酸酶抑制劑的研究[A];2010年中國(guó)農(nóng)業(yè)工程學(xué)會(huì)農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏工程分會(huì)學(xué)術(shù)年會(huì)暨華南地區(qū)農(nóng)產(chǎn)品加工產(chǎn)學(xué)研研討會(huì)論文摘要集[C];2010年

10 張智武;許建香;孫麗萍;;蜂膠對(duì)酪氨酸酶體外活性的影響[A];海峽兩岸第六屆蜜蜂與蜂產(chǎn)品研討會(huì)論文集[C];2007年

中國(guó)重要報(bào)紙全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前7條

1 張正棋;[N];中國(guó)食品報(bào);2009年

2 ;[N];大眾科技報(bào);2004年

3 潘祥龍（上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院 副主任醫(yī)師）;[N];上海中醫(yī)藥報(bào);2002年

4 程克銘;[N];民族醫(yī)藥報(bào);2004年

5 湖北遠(yuǎn)安縣中醫(yī)院主任醫(yī)師 胡獻(xiàn)國(guó);[N];大眾衛(wèi)生報(bào);2009年

6 常敏毅;[N];大眾衛(wèi)生報(bào);2005年

7 河北 柴玉花;[N];民族醫(yī)藥報(bào);2002年

中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 莊江興;α-synuclein蛋白及抑制劑對(duì)酪氨酸酶的調(diào)控機(jī)制[D];廈門大學(xué);2009年

2 郭靜;Streptomyces kathirae SC-1黑色素合成關(guān)鍵酶酪氨酸酶基因的克隆表達(dá)及分子改造[D];江南大學(xué);2015年

3 宋康康;抑制劑對(duì)酪氨酸酶的效應(yīng)及其對(duì)黑色素生成調(diào)控的研究[D];廈門大學(xué);2007年

4 王芳;桑葉中酪氨酸酶抑制成分的研究[D];浙江工商大學(xué);2008年

5 黃曉偉;三種植物揮發(fā)油的化學(xué)成分、酪氨酸酶抑制能力及抗氧化活性的研究[D];華中科技大學(xué);2013年

6 穆燕;千日紅酪氨酸酶抑制劑的分離純化及其抑制機(jī)理研究[D];華南理工大學(xué);2012年

7 張永兵;竹葉提取物對(duì)酪氨酸酶和黑色素瘤細(xì)胞的影響[D];中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院;2009年

8 傅國(guó)強(qiáng);中藥對(duì)體外黑素生成影響的研究[D];中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué);2002年

9 朱祥枝;藥用柑果主要藥用成分及其對(duì)酪氨酸酶抑制作用研究[D];福建農(nóng)林大學(xué);2005年

10 劉楠;蘇云金芽孢桿菌酪氨酸酶純化、性質(zhì)研究及其mel基因的克隆和表達(dá)[D];武漢大學(xué);2004年

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 張曉晴;香樟果實(shí)酪氨酸酶的分離、純化和性質(zhì)分析[D];江南大學(xué);2008年

2 陳懿;二甲基亞砜對(duì)酪氨酸酶活性影響的研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2009年

3 張晶;常用�？浦兴幚野彼崦敢种苿┭芯縖D];華東理工大學(xué);2011年

4 于雪;長(zhǎng)牡蠣酪氨酸酶基因家族的克隆、表達(dá)和系統(tǒng)發(fā)生分析[D];中國(guó)海洋大學(xué);2014年

5 張麗娟;苯甲酸衍生物對(duì)酪氨酸酶的效應(yīng)及其抑菌作用[D];廈門大學(xué);2006年

6 張廷紅;固定化酪氨酸酶的制備及部分性質(zhì)研究[D];四川大學(xué);2005年

7 馬景昕;中藥乙醇提取物對(duì)豚鼠皮膚酪氨酸酶mRNA水平的影響[D];大連醫(yī)科大學(xué);2003年

8 張春樂(lè);抑制劑對(duì)蘑菇酪氨酸酶的抑制效應(yīng)及抗菌活性[D];廈門大學(xué);2007年

9 汪雯;酪氨酸酶七肽抑制劑的篩選及其柔性脂質(zhì)體的制備[D];東華大學(xué);2012年

10 李超;與酪氨酸酶相互作用蛋白的鑒定和作用機(jī)制研究[D];蘇州大學(xué);2014年

  本文關(guān)鍵詞：Streptomyces kathirae SC-1黑色素合成關(guān)鍵酶酪氨酸酶基因的克隆表達(dá)及分子改造，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：157620