本文關(guān)鍵詞：G蛋白偶聯(lián)受體2在細(xì)胞膜上控制蛻皮激素信號通路及調(diào)控下游效應(yīng)的研究　出處：《山東大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：研究背景及國內(nèi)外研究進(jìn)展昆蟲是世界上種類最多的生物類群,其發(fā)育大多數(shù)經(jīng)歷蛻皮和變態(tài)兩種主要的生理過程。昆蟲的生長發(fā)育主要由蛻皮激素(20E)和保幼激素(JH)控制。在昆蟲幼蟲階段JH滴度較高,蟲體維持其幼蟲狀態(tài);在蛻皮變態(tài)期JH滴度逐漸降低,而此時20E滴度逐漸升高,最終起始昆蟲的蛻皮變態(tài)。這兩種激素協(xié)調(diào)控制昆蟲的蛻皮與變態(tài)過程。研究這一過程的分子調(diào)控機(jī)制不僅可以為害蟲防治提供科學(xué)依據(jù),而且可以為研究人類疾病的分子機(jī)制提供參考。先前研究發(fā)現(xiàn)蛻皮激素主要是通過核受體ecdysone receptor(EcR)途徑轉(zhuǎn)導(dǎo)信號起始昆蟲的變態(tài)。近些年,隨著分子生物學(xué)技術(shù)水平的日趨提高,研究人員發(fā)現(xiàn)了 20E激素信號通路存在非基因組途徑。許多信號通路中的蛋白質(zhì)會發(fā)生快速的磷酸化修飾及移位現(xiàn)象。20E也可動員細(xì)胞內(nèi)鈣離子的釋放及內(nèi)流。與此同時,20E非基因組途徑的膜受體也成為研究的熱點。目前在許多物種中都發(fā)現(xiàn)了 G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)參與動物類固醇激素的非基因組信號通路,但是具體的機(jī)制尚不清楚。鈣離子是細(xì)胞內(nèi)的第二信使,調(diào)控多種生理過程,包括基因轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡等。類固醇激素20E在昆蟲變態(tài)過程中促進(jìn)程序性細(xì)胞死亡,而保幼激素JH拮抗20E的功能來阻止變態(tài)的發(fā)生。20E和JH都能誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平的增加。然而,這兩種功能相互拮抗的激素誘導(dǎo)鈣離子水平增加的分子機(jī)制及生理結(jié)果仍不明確。在這項研究中,我們篩選到在鱗翅目昆蟲棉鈴蟲中的ErGPCR-2作為靶標(biāo)基因,研究GPCR在20E非基因組途徑中的功能,以及鈣離子作為第二信使在20E調(diào)控的細(xì)胞凋亡中的分子機(jī)制。豐富和完善了 20E信號途徑及昆蟲生長發(fā)育的理論知識。同時為害蟲防治及人類疾病治療提供靶標(biāo)基因和科學(xué)依據(jù)。研究結(jié)果1.G蛋白偶聯(lián)受體2在細(xì)胞膜上控制蛻皮激素信號通路在這項研究中,我們篩選到了鱗翅目昆蟲棉鈴蟲中的一個GPCR,命名為ErGPCR-2,在細(xì)胞膜上控制類固醇激素20-羥基蛻皮酮信號通路。ErGPCR-2在棉鈴蟲的蛻皮和變態(tài)時期具有較高的表達(dá)。20E通過ErGPCR-2調(diào)控棉鈴蟲表皮細(xì)胞系中鈣離子水平快速變化、有關(guān)蛋白質(zhì)的磷酸化、相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄以及蟲體的變態(tài)發(fā)育過程。ErGPCR-2定位于細(xì)胞膜上,在20E的誘導(dǎo)條件下,ErGPCR-2會被G蛋白偶聯(lián)受體激酶2(GRK2)所磷酸化,磷酸化修飾后的ErGPCR-2被內(nèi)吞入細(xì)胞質(zhì)中。內(nèi)吞入細(xì)胞質(zhì)后的ErGPCR-2被蛋白酶所降解,最終脫敏20E信號通路。細(xì)胞系干擾ErGPCR-2減少了 20E的類似物[3H]ponasterone A([3H]Pon A)進(jìn)入細(xì)胞的量。細(xì)胞系過表達(dá)ErGPCR-2和干擾GRK2阻止ErGPCR-2的內(nèi)吞,都會增加[3H]Pon A進(jìn)入細(xì)胞的量。然而,我們沒有檢測到ErGPCR-2蛋白直接結(jié)合于[3H]Pon A。結(jié)果表明ErGPCR-2在細(xì)胞膜上傳導(dǎo)類固醇激素20E信號并且控制20E進(jìn)入細(xì)胞。2.蛻皮激素促進(jìn)鈣離子動員并引起細(xì)胞凋亡20E通過GPCR誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)較強(qiáng)的鈣離子水平升高,而JH通過受體酪氨酸激酶(RTKs)誘導(dǎo)較小的鈣離子水平增加。鈣釋放激活鈣通道1(Orai 1)和瞬時受體電位通道(TRPs Channel),對20E誘導(dǎo)快速鈣離子內(nèi)流是必需的。相對于JH,20E處理細(xì)胞會引起鈣離子維持在長時間的高水平狀態(tài),并且提高了更多的鈣通道相關(guān)基因的表達(dá),包括Orai1和TRP通道等。20E會激活Caspase3/7和促凋亡基因的表達(dá),而JH不能。JH可以抑制20E誘導(dǎo)的鈣內(nèi)流、Caspase3/7的激活和凋亡相關(guān)基因的表達(dá)。高水平的鈣離子誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。這些結(jié)果表明,20E和JH通過不同的途徑調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣并且維持鈣離子在不同的穩(wěn)態(tài)水平,因此導(dǎo)致不同的基因表達(dá)和細(xì)胞生理反應(yīng)。研究結(jié)論及科學(xué)意義1.ErGPCR-2在細(xì)胞膜上控制20E進(jìn)入細(xì)胞ErGPCR-2定位于細(xì)胞膜上控制[3H]Pon A進(jìn)入細(xì)胞。ErGPCR-2在細(xì)胞膜上調(diào)控20E信號通路。這一研究完善了 20E非基因組途徑的科學(xué)知識,建立了基因組途徑與非基因組途徑的連接,為今后研究20E信號途徑提供了全新的理論依據(jù)。2.蛻皮激素促進(jìn)鈣離子動員引起細(xì)胞凋亡20E通過GPCR動員細(xì)胞內(nèi)較強(qiáng)的鈣水平升高,而JH通過RTKs動員較弱的鈣水平增加。20E處理細(xì)胞會引起鈣離子在細(xì)胞質(zhì)中維持在長時間的高水平狀態(tài),20E上調(diào)更多鈣通道相關(guān)基因的表達(dá)。20E誘導(dǎo)Caspase3/7活化水平、促進(jìn)細(xì)胞細(xì)胞死亡和上調(diào)促凋亡基因的表達(dá),高水平的鈣離子誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。鈣離子作為細(xì)胞中重要的第二信使,在細(xì)胞增殖凋亡過程中發(fā)揮重要的功能。20E通過GPCR途徑動員鈣離子使其維持高水平的穩(wěn)態(tài),最終細(xì)胞中高水平的鈣離子誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡。這一研究證實了鈣離子在細(xì)胞凋亡中的功能,不僅為完善昆蟲凋亡的分子機(jī)制做出貢獻(xiàn),也為癌癥治療中促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡提供科學(xué)依據(jù)。
[Abstract]:Research background and research progress at home and abroad, insects are the most diverse species in the world. Their development mostly occurs through two main physiological processes: molting and metamorphosis. The development of insect mainly by ecdysone (20E) and juvenile hormone (JH) control. In insect larvae stage, JH titer is higher, and the worm body maintains its larval state. In the molting metamorphosis stage, JH titer gradually decreases, and at this time 20E titer gradually increases, and finally starts the insect's molting metamorphosis. These two hormones coordinate the molting and metamorphosis of insects. The study of the molecular mechanism of this process not only provides a scientific basis for pest control, but also provides a reference for the study of molecular mechanisms of human diseases. Previous research found that ecdysone mainly through nuclear receptor ecdysone receptor (EcR) signaling pathway starting insect metamorphosis. In recent years, with the increasing level of molecular biology, researchers have discovered that there is a non genomic pathway in the 20E hormone signaling pathway. Many proteins in the signal pathways have rapid phosphorylation and displacement. 20E can also mobilize the release and inflow of intracellular calcium ions. At the same time, the membrane receptors of the non genomic pathway of 20E have also become a hot spot of research. G protein coupled receptors (GPCR) are involved in the non genomic signaling pathways of steroid hormones in many species, but the specific mechanisms are not yet clear. Calcium ion is the second messenger within the cell that regulates a variety of physiological processes, including gene transcription, cell proliferation and cell apoptosis. Steroid hormone 20E promotes programmed cell death during insect metamorphosis, while protective hormone JH antagonists the function of 20E to prevent the occurrence of metamorphosis. Both 20E and JH can induce the increase of intracellular calcium levels. However, the molecular mechanisms and physiological results of the increased levels of calcium ion induced by these two antagonistic hormones are still unclear. In this study, we screened ErGPCR-2 in the lepidopteran insect Helicoverpa armigera as a target gene, studied the function of GPCR in 20E non genomic pathway, and the molecular mechanism of calcium as a second messenger in 20E regulated cell apoptosis. The theoretical knowledge of the 20E signal pathway and the growth and development of insects has been enriched and perfected. At the same time, it provides the target gene and scientific basis for the pest control and the treatment of human disease. The research results of 1.G protein coupled receptor 2 in the cell membrane of control ecdysone signaling pathway in this study, we screened a GPCR cotton bollworm in, named ErGPCR-2, to control the steroid 20- HYDROXYECDYSONE signaling pathway in cell membrane. ErGPCR-2 has high expression in the period of molt and metamorphosis of Helicoverpa armigera. 20E regulates the rapid change of calcium ion level, the phosphorylation of related proteins, the transcription of related genes and the metamorphosis of worms in the cotton bollworm epidermis cell line by ErGPCR-2. ErGPCR-2 was localized on the cell membrane. Under the induction of 20E, ErGPCR-2 was phosphorylated by G protein coupled receptor kinase 2 (GRK2), and phosphorylated ErGPCR-2 was swallowed into the cytoplasm. After endocytosis of the cytoplasm, ErGPCR-2 was degraded by protease and eventually desensitized to the 20E signaling pathway. The interference of ErGPCR-2 in cell lines reduces the amount of 20E's analogues, [3H]ponasterone A ([3H]Pon A), into the cell. The overexpression of ErGPCR-2 in the cell line and the interference of GRK2 to prevent endocytosis of ErGPCR-2 will increase the amount of [3H]Pon A into the cell. However, we did not detect the direct binding of ErGPCR-2 protein to [3H]Pon A. The results showed that ErGPCR-2 uploads the steroid hormone 20E signal in the cell membrane and controls the entry of 20E into the cell. Calcium mobilization and apoptosis induced by 20E strong intracellular calcium levels increased by 2. GPCR and JH by promoting ecdysone, receptor tyrosine kinase (RTKs) levels of calcium induced smaller increase. Calcium release activates calcium channel 1 (Orai 1) and transient receptor potential channel (TRPs Channel), which is essential for 20E induced fast calcium influx. Compared with JH, 20E treated cells can cause calcium to maintain at a high level for a long time, and increase the expression of more calcium channel related genes, including Orai1 and TRP channels. 20E activates Caspase3/7 and the expression of apoptotic genes, but JH does not. JH can inhibit 20E induced calcium influx, activation of Caspase3/7 and the expression of apoptosis related genes. High levels of calcium induced apoptosis. These results indicate that 20E and JH regulate intracellular calcium through different pathways and maintain calcium at different steady-state levels, resulting in different gene expression and cellular physiological responses. Research conclusions and scientific significance 1.ErGPCR-2 control the entry of 20E into cell ErGPCR-2 on cell membrane to control the entry of [3H]Pon A into the cell membrane. ErGPCR-2 regulates the 20E signaling pathway on the cell membrane. This research has improved the scientific knowledge of 20E's non genomic approach, and established the connection between genomic pathways and non genomic pathways, providing a new theoretical basis for future research on 20E signaling pathways. Calcium mobilization induced apoptosis through 20E GPCR mobilization of intracellular calcium level of high calcium levels and promote 2. ecdysone, JH mobilized by RTKs is increased. 20E treatment cells cause calcium ions to maintain a long high level in the cytoplasm, and 20E up-regulated the expression of more calcium channel related genes. 20E induced Caspase3/7 activation level, cell death and up regulation of apoptosis gene expression, and high level of calcium ion induced apoptosis. As an important second messenger in cells, calcium ions play an important role in the process of cell proliferation and apoptosis. 20E mobilizes calcium ions by GPCR to maintain a high level of homeostasis, and at last the high level of calcium ions in the cells induce apoptosis. This study confirmed the apoptosis of calcium ions in cells
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：Q25

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本文編號：1340919