本文關(guān)鍵詞：枯草芽孢桿菌及鏈霉菌表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建及應(yīng)用研究　出處：《江南大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)和鏈霉菌(Streptomyces)表達(dá)系統(tǒng)最突出的特點(diǎn)是宿主菌具有GRAS(generally recognized as safe)地位,而且遺傳背景清楚,遺傳操作系統(tǒng)完善,具有開(kāi)發(fā)成為繼乳酸菌之后的食品級(jí)表達(dá)系統(tǒng)的潛能。雖然關(guān)于B.subtilis和Streptomyces表達(dá)系統(tǒng)的研究已經(jīng)取得了一定的進(jìn)展,但在表達(dá)調(diào)控元件開(kāi)發(fā)及表達(dá)系統(tǒng)多樣性方面,還遠(yuǎn)落后于Escherichia coli表達(dá)系統(tǒng)。本論文對(duì)B.subtilis內(nèi)的啟動(dòng)子進(jìn)行了比較并改造,構(gòu)建B.subtilis高效分泌表達(dá)系統(tǒng);利用B.subtilis群體感應(yīng)現(xiàn)象-感受態(tài)形成的信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng),構(gòu)建新型細(xì)胞密度依賴型自誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)。另外,利用Streptomyces hygroscopicus WSH03-13來(lái)源的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶(transglutaminase,TGase)的啟動(dòng)子(P_(tg))及信號(hào)肽(SP_(tg))的預(yù)測(cè)序列構(gòu)建Streptomyces分泌表達(dá)系統(tǒng)。具體研究?jī)?nèi)容如下:(1)B.subtilis高效分泌表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建。以AP為報(bào)告蛋白,構(gòu)建表達(dá)載體,對(duì)比分析了啟動(dòng)子PHpa II、PyxiE、P43、PgsiB、Pluxs、Papr E和Pgrac的表達(dá)量及表達(dá)曲線。結(jié)果顯示,啟動(dòng)子的活性及表達(dá)時(shí)間之間存在差異,其中,啟動(dòng)子PHpa II和PgsiB的活性最高。將6種啟動(dòng)子PHpa II、PyxiE、P43、PgsiB、Pluxs和Papr E分別與PHpa II串聯(lián)后表達(dá)AP,結(jié)果顯示PHpaII和Pgsi B串聯(lián)后表達(dá)量提高最多。在此基礎(chǔ)上篩選20種信號(hào)肽,構(gòu)建高效分泌表達(dá)載體pBSG24-SPYncM。以B.subtilis WB600為宿主進(jìn)行5 L發(fā)酵罐放大實(shí)驗(yàn),AP的分泌表達(dá)產(chǎn)量達(dá)到1.7g/L。(2)B.subtilis細(xì)胞密度依賴型自誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建。構(gòu)建E.coli-B.subtilis穿梭載體pBSG01,以綠色熒光蛋白(GFP)為報(bào)告蛋白,研究srf操縱子的啟動(dòng)子PsrfA的表達(dá)特性。通過(guò)測(cè)定熒光強(qiáng)度和菌體生長(zhǎng)曲線發(fā)現(xiàn),PsrfA的表達(dá)呈現(xiàn)細(xì)胞密度依賴性。在四種營(yíng)養(yǎng)梯度培養(yǎng)基中,LB培養(yǎng)基更適于PsrfA的表達(dá)。與PHpaII相比,PsrfA的表達(dá)量高于PHpaII。PsrfA可在四種宿主B.subtilis 168、B.subtilis WB600和B.subtilis WB800和BSG1681(ΔPsrfA)中高表達(dá)GFP,其中,宿主B.subtilis 168中的表達(dá)量最高,缺失基因組中的PsrfA并沒(méi)有增加系統(tǒng)表達(dá)量。在培養(yǎng)基中添加1.5%的葡萄糖,啟動(dòng)子活性提高了1.2倍,系統(tǒng)表達(dá)量提高了4.6倍。將PsrfA的-10區(qū)和-35區(qū)突變?yōu)棣褹依賴的保守的-10區(qū)和-35區(qū),啟動(dòng)子活性提高了2倍;添加1.5%的葡萄糖后,系統(tǒng)表達(dá)量進(jìn)一步提高了8倍。利用該表達(dá)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了異源蛋白AP分泌表達(dá)。(3)B.subtilis細(xì)胞密度依賴型自誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)化及高細(xì)胞密度發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。構(gòu)建產(chǎn)孢缺陷宿主菌BSG1682(ΔσF),與B.subtilis 168做宿主進(jìn)行了比較。結(jié)果顯示,表達(dá)GFP時(shí),BSG1682(ΔσF)表達(dá)量比B.subtilis 168提高60%。將PsrfA-gfp整合到染色體表達(dá)時(shí),整合PsrfA-gfp未影響菌體生長(zhǎng),表達(dá)量低于載體表達(dá)。將PsrfA的-10區(qū)、-35區(qū)及-16區(qū)分別或組合突變?yōu)橄鄳?yīng)的保守序列,發(fā)現(xiàn)突變-35區(qū)后表達(dá)量是對(duì)照PsrfA的2.5倍。將PsrfA分別與PHpa II和PgsiB串聯(lián),PsrfA-PHpa II(P17)的表達(dá)區(qū)間不變但表達(dá)量增加,PsrfA-Pgsi B(P16)表達(dá)區(qū)間沒(méi)有明顯延長(zhǎng)且表達(dá)量降低。對(duì)P17的核心區(qū)進(jìn)行組合突變,獲得10個(gè)突變體,其中P23的表達(dá)量最高。含P23的表達(dá)系統(tǒng)可以實(shí)現(xiàn)異源蛋白納豆激酶(NK)和AP時(shí)的高效表達(dá)。對(duì)含P23的表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行發(fā)酵放大實(shí)驗(yàn),生物量(OD600)可達(dá)30,是搖瓶實(shí)驗(yàn)的3.2倍;GFP的熒光強(qiáng)度是搖瓶的85%,但GFP的熒光量卻是搖瓶的2.7倍。通過(guò)條件優(yōu)化,進(jìn)行高細(xì)胞密度發(fā)酵時(shí)的菌體濃度OD600達(dá)到122。(4)Streptomyces分泌表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建。利用P_(tg)-SP_(tg)為表達(dá)元件并在SP_(tg)的下游添加便于外源基因插入的多克隆位點(diǎn)(MCS)及提高轉(zhuǎn)錄效率的終止子(fd-ter),構(gòu)建載體pSG01。利用該載體可在S.lividans1326中分泌表達(dá)TGase。對(duì)SP_(tg)序列中的鏈霉菌亮氨酸稀有密碼子和信號(hào)肽酶識(shí)別位點(diǎn)優(yōu)化后得到載體pSG02,利用該載體表達(dá)TGase時(shí)分泌表達(dá)量提高一倍。通過(guò)對(duì)TGase進(jìn)行N-端測(cè)序,得到的N-端氨基酸序列與野生型一致,說(shuō)明該表達(dá)系統(tǒng)能夠成功分泌表達(dá)TGase。與鏈霉菌常用啟動(dòng)子PermE*表達(dá)TGase比較發(fā)發(fā)現(xiàn),P_(tg)的表達(dá)量是PermE*的2.1倍,說(shuō)明P_(tg)可作為一種強(qiáng)啟動(dòng)子用于鏈霉菌表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建。該表達(dá)載體可在其他鏈霉菌宿主中內(nèi)分泌表達(dá)TGase以及異源蛋白苯丙氨酸脫氨酶(PAL)和氨肽酶(AP)。另外,對(duì)P_(tg)及SP_(tg)在E.coli中的功能進(jìn)行了研究,結(jié)果顯示,SP_(tg)在E.coli系統(tǒng)中能分泌TGase,而P_(tg)在E.coli系統(tǒng)中不能表達(dá)TGase。
【學(xué)位授予單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：Q78

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