本文關(guān)鍵詞：低氧狀態(tài)下肌紅蛋白促骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞分化　出處：《南華大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BM-MSCs)由于其具備來源豐富、可多向分化、且免疫原性低等優(yōu)勢,已廣泛應(yīng)用于組織修復(fù)、血管新生和細(xì)胞治療,是再生醫(yī)學(xué)研究中的重要種子細(xì)胞。然而BM-MSCs本身的生存環(huán)境氧濃度僅為2-8%,且當(dāng)BM-MSCs移植入體內(nèi)時也會遭遇低氧(Hypoxia)的病理生理環(huán)境。但目前常規(guī)的體外細(xì)胞實驗通常都是在21%的正常氧濃度下進(jìn)行,這與BM-MSCs的生理微環(huán)境,以及移植入體內(nèi)的微環(huán)境不符。因此,研究低氧對BM-MSCs的生長以及分化等生物學(xué)行為的影響及其相關(guān)機制至關(guān)重要。氧不僅是生命體生存的必要條件,也是維持能量代謝及細(xì)胞功能的重要調(diào)節(jié)因素。但機體多種細(xì)胞都是處于生理或病理性低氧狀態(tài)中。當(dāng)氧供應(yīng)不足時,低氧的信號即會迅速傳遞至細(xì)胞內(nèi),啟動相關(guān)基因及蛋白的表達(dá),從而維持細(xì)胞和機體內(nèi)的平衡。肌紅蛋白(Myoglobin,Mb)作為一種十分重要的含鐵攜氧珠蛋白,其貯存和運輸氧的功能已被人們所熟知,然而Mb還存在多重生物催化功能,如過氧化物酶(Peroxidase)和水解酶(Hydrolase)催化活性等。在不同生理與病理條件下,Mb的生物學(xué)功能也有所不同。在低氧狀態(tài)下,Mb具有一項非常重要的功能——亞硝酸鹽還原酶(Nitrite reductase,NIR)催化活性,低氧時Mb血紅素中心的鐵可與亞硝酸鹽(nitrite,NO_2ˉ)結(jié)合,進(jìn)而催化其還原生成一氧化氮(nitric oxide,NO)(NO_2ˉ+deoxy Mb(Fe 2+)+2 H+→NO+met Mb(Fe 3+)+H2O)。研究發(fā)現(xiàn),低氧條件下,NO能通過抑制缺氧誘導(dǎo)因子-1a(hypoxia inducible factor-1a,HIF-1a)的降解,促進(jìn)多種生長因子的表達(dá),調(diào)節(jié)細(xì)胞對低氧的應(yīng)答,進(jìn)一步影響細(xì)胞的生物學(xué)功能。Mb作為具有NIR催化活性的血紅素蛋白,對氧濃度的改變極其敏感,但其在BM-MSCs中能否通過調(diào)節(jié)NO的生成,從而影響干細(xì)胞的增殖與分化目前尚不明了。本實驗通過模擬骨髓內(nèi)的低氧張力(2%O_2)對豬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Porcine bone marrow mesenchymal stem cells,p BM-MSCs)進(jìn)行體外培養(yǎng),并誘導(dǎo)其向內(nèi)皮細(xì)胞定向分化;并探討Mb在低氧狀態(tài)下對p BM-MSCs向內(nèi)皮細(xì)胞分化中的作用及其可能機制。第一部分:低氧促進(jìn)豬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞定向分化為內(nèi)皮細(xì)胞目的:觀察骨髓生理低氧濃度對豬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(p BM-MSCs)向內(nèi)皮細(xì)胞定向分化的影響。方法:采用密度梯度離心與貼壁篩選法相結(jié)合的方法分離培養(yǎng)p BM-MSCs。通過顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化,采用流式細(xì)胞儀對p BM-MSCs的純度進(jìn)行鑒定。分別于常氧(21%)及低氧(2%)條件下體外誘導(dǎo)p BM-MSCs定向分化為內(nèi)皮樣細(xì)胞,然后采用實時熒光定量PCR(Quantificational real-time polymerase chain reaction,q RT-PCR)以及Western blot法檢測p BM-MSCs誘導(dǎo)分化后內(nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)志物血管內(nèi)皮鈣黏蛋白(VE-Cadherin)與血管性假血友病因子(von Willebrand factor,v WF)的m RNA和蛋白表達(dá)水平。細(xì)胞活性檢測試劑CCK-8檢測低氧對p BM-MSCs增殖的影響,血管生成實驗檢測低氧對p BM-MSCs誘導(dǎo)分化后細(xì)胞成管能力的影響。結(jié)果:經(jīng)顯微鏡下觀察以及流式細(xì)胞術(shù)分析,本實驗獲得的細(xì)胞為干細(xì)胞表面標(biāo)志物CD44/CD90雙陽性高達(dá)96.3%,CD14/CD45雙陰性率為95.8%的高純度p BM-MSCs。常氧下采用內(nèi)皮細(xì)胞完全培養(yǎng)基(EBM-2)和EBM-2+VEGF-A165(50 ng/m L)分別作為誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基,體外誘導(dǎo)分化10天后,可見細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了明顯的變化:由長梭形變?yōu)閳A形或橢圓形,且具有內(nèi)皮細(xì)胞特征性的鋪路石樣排列。q RT-PCR與Western blot檢測均顯示誘導(dǎo)分化組內(nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)志物VE-Cadherin與v WF的表達(dá)高于未誘導(dǎo)組(P0.05),說明p BM-MSCs可在常氧下定向誘導(dǎo)分化為內(nèi)皮樣細(xì)胞。采用CCK-8監(jiān)測p BM-MSCs在低氧及常氧下的增殖情況,結(jié)果顯示低氧能促進(jìn)p BM-MSCs的增殖。接下來分別在低氧及常氧條件下利用EBM-2對p BM-MSCs進(jìn)行定向誘導(dǎo)72 h。q RT-PCR以及Western blot檢測結(jié)果均提示低氧下能促進(jìn)p BM-MSCs定向分化為高表達(dá)VE-Cadherin與v WF(與常氧誘導(dǎo)組相比,P0.01)的內(nèi)皮樣細(xì)胞,且在72 h即能顯示出明顯的誘導(dǎo)效果;體外血管生成實驗也發(fā)現(xiàn)低氧誘導(dǎo)下的p BM-MSCs具有更強的血管生成能力。以上結(jié)果說明低氧能促進(jìn)p BM-MSCs體外定向分化為內(nèi)皮樣細(xì)胞。第二部分:肌紅蛋白的結(jié)構(gòu)與NIR功能目的:探討人肌紅蛋白(human myoglobin,h Mb)及其突變體蛋白C110A-h Mb的結(jié)構(gòu)以及在低氧下的NIR活性。方法:本實驗采用氨基酸定點突變技術(shù)構(gòu)建h Mb突變體蛋白C110A-h Mb基因,并通過表達(dá)純化獲得h Mb及C110A-h Mb兩種蛋白。利用氨基酸序列比對,聚丙烯凝膠電泳以及紫外-可見光譜(UV-vis)分析兩種蛋白的光譜學(xué)特征和血紅素活性中心構(gòu)象的差別,并采用吡啶光譜法測定兩種蛋白的摩爾消光系數(shù)。采用紫外動力學(xué)以及電子順磁共振(Electron paramagnetic resonance,EPR)波譜方法比較h Mb,C110A-h Mb以及野生型抹香鯨Mb(Sperm whale myoglobin,sw Mb)的NIR催化活性。結(jié)果:h Mb是唯一具有半胱氨酸(Cysteine,Cys)殘基的Mb,為了解Cys對h Mb結(jié)構(gòu)與功能的影響,本實驗采用定點突變方法構(gòu)建了突變體基因,成功轉(zhuǎn)化后,抽提質(zhì)粒測序正確,h Mb及C110A-h Mb質(zhì)粒均為目標(biāo)基因。通過表達(dá)、純化獲得以上兩種蛋白。聚丙烯凝膠電泳發(fā)現(xiàn)h Mb存在二聚體形式,而C110A-h Mb僅以單體形式存在,說明Cys是導(dǎo)致h Mb出現(xiàn)二聚體的關(guān)鍵原因(蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間形成二硫鍵)。進(jìn)一步通過紫外-可見光譜分析發(fā)現(xiàn),兩種蛋白均存在特征性吸收峰:409 nm的Soret峰以及500 nm和625 nm的α/β吸收峰,這與野生型sw Mb的紫外光譜圖非常相似,說明二聚體的存在并沒有影響Mb的血紅素活性中心的構(gòu)象。利用紫外動力學(xué)檢測方法測定還原態(tài)Mb催化NO_2ˉ還原為NO的動力學(xué)參數(shù),并進(jìn)一步通過二級反應(yīng)速率的測試進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)突變體蛋白C110A-h Mb與野生型sw Mb的NIR活性極其相似,且稍高于h Mb。接著通過EPR波譜觀察,同樣證實在低氧條件下,h Mb及C110A-h Mb以及sw Mb均具有類似的NIR活性,能促進(jìn)NO的產(chǎn)生。以上研究結(jié)果說明,盡管h Mb存在二聚體的形式,但由于Cys110遠(yuǎn)離血紅素活性中心結(jié)構(gòu),因而構(gòu)象沒有受到明顯的影響,所以其NIR催化活性也沒有很大的差異。說明在低氧狀態(tài)下,Mb存在穩(wěn)定的NIR活性。第三部分:低氧下Mb促p BM-MSCs分化為內(nèi)皮細(xì)胞的作用目的:探討Mb在低氧狀態(tài)下促進(jìn)p BM-MSCs定向分化為內(nèi)皮細(xì)胞中的作用及機制。方法:采用q RT-PCR、Western blot以及免疫熒光(Immunofluorescence,IF)方法檢測p BM-MSCs中是否存在Mb的表達(dá)。通過q RT-PCR、Western blot以及IF方法,研究Mb在常氧與低氧濃度下誘導(dǎo)p BM-MSCs定向分化為內(nèi)皮細(xì)胞過程中的表達(dá)情況。同時采用Griess實驗及NO熒光探針方法分別檢測p BM-MSCs細(xì)胞培養(yǎng)上清及細(xì)胞內(nèi)NO的變化情況,采用q RT-PCR與Western blot檢測HIF-1α以及血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表達(dá)情況,ELISA檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清VEGF水平。進(jìn)而采用Mb si RNA方法進(jìn)一步探討Mb在低氧狀態(tài)下,促進(jìn)p BM-MSCs定向分化為內(nèi)皮細(xì)胞中的作用機制。結(jié)果:通過q RT-PCR,Western blot以及IF方法證實p BM-MSCs存在Mb的表達(dá),且主要定位于p BM-MSCs的胞漿中。在常氧狀態(tài)下,對p BM-MSCs向內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行定向誘導(dǎo)分化10天,而后通過Western blot檢測,發(fā)現(xiàn)在此過程中,Mb的表達(dá)沒有明顯變化。接下來分別在低氧以及常氧條件下培養(yǎng)p BM-MSCs,通過Western Blot檢測結(jié)果顯示在低氧組,Mb的表達(dá)隨著培養(yǎng)時間的延長有所增高。而在低氧誘導(dǎo)p BM-MSCs定向分化72 h的實驗中,低氧誘導(dǎo)組Mb的表達(dá)較常氧誘導(dǎo)組明顯增高,在誘導(dǎo)分化72 h后兩組的差異最為顯著(P0.01),且呈時間依賴性。同時采用Griess實驗及NO熒光探針方法分別檢測p BM-MSCs細(xì)胞培養(yǎng)上清及細(xì)胞內(nèi)NO的變化情況,通過q RT-PCR與Western blot檢測HIF-1α/VEGF的表達(dá)情況,ELISA檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清VEGF水平。結(jié)果顯示:NO的水平以及HIF-1α/VEGF在低氧誘導(dǎo)組的表達(dá)均較常氧組顯著增高(P0.05),與Mb的表達(dá)情況一致。采用si RNA技術(shù)在p BM-MSCs中下調(diào)Mb基因的表達(dá)后,結(jié)果發(fā)現(xiàn)Mb基因沉默后,對p BM-MSCs中NO的生成有明顯的抑制作用,而后HIF-1α與VEGF蛋白的表達(dá)也出現(xiàn)了顯著的降低,而內(nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)志物VE-Cadherin與v WF的表達(dá)也隨之下降,細(xì)胞管腔樣結(jié)構(gòu)形成顯著受到抑制。說明Mb在低氧狀態(tài)促進(jìn)p BM-MSCs定向分化為內(nèi)皮細(xì)胞的過程中起著重要的作用。結(jié)論:1.2%低氧可以促進(jìn)p BM-MSCs定向誘導(dǎo)分化為具有較強成管能力,且高表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞特征性標(biāo)志物VE-Cadherin與v WF的內(nèi)皮樣細(xì)胞。2.Mb具有高度同源性,h Mb存在二聚體與Cys110密切相關(guān),但其并不影響血紅素活性中心的結(jié)構(gòu)。h Mb及其突變體C110A-h Mb結(jié)構(gòu)相似,具有催化強度相近的NIR活性,均能在低氧環(huán)境下催化NO_2ˉ還原為NO。3.BM-MSCs中存在Mb的表達(dá)。2%低氧濃度下,Mb通過其NIR活性催化NO_2ˉ還原產(chǎn)生NO,進(jìn)而通過HIF-1α/VEGF途徑促進(jìn)p BM-MSCs向內(nèi)皮細(xì)胞定向分化。
【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R329.2

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本文編號：1336199