發(fā)布時(shí)間：2017-12-26 02:02

  本文關(guān)鍵詞：豬圓環(huán)病毒2型激活鈣離子信號通路誘導(dǎo)PK-15細(xì)胞自噬　出處：《浙江大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type 2, PCV2)是導(dǎo)致豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾病(Porcine circovirus-associated disease, PCVAD)的主要致病因子,主要感染豬體免疫器官,造成淋巴組織損傷、淋巴細(xì)胞減少及組織細(xì)胞浸潤等病理學(xué)特征,最終可導(dǎo)致嚴(yán)重的免疫抑制。此外,PCV2感染后極易導(dǎo)致豬群繼發(fā)感染和混合感染,給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重?fù)p失。PCV2基因組全長1.7 kb,為共價(jià)閉合、環(huán)狀單鏈DNA。迄今已報(bào)道PCV2有5個(gè)ORF編碼蛋白：ORF1編碼復(fù)制相關(guān)蛋白R(shí)ep,負(fù)責(zé)病毒DNA的復(fù)制；ORF2編碼核衣殼蛋白Cap,與病毒粒子包裝及細(xì)胞自噬有關(guān),也是PCV2主要的免疫原性蛋白；ORF3編碼蛋白能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡;ORF4編碼蛋白能夠抑制細(xì)胞凋亡,調(diào)控宿主T淋巴細(xì)胞；ORF5編碼蛋白能夠誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。細(xì)胞自噬在病毒的感染、復(fù)制以及致病方面均發(fā)揮重要作用,本實(shí)驗(yàn)室前期工作證實(shí)PCV2感染PK-15細(xì)胞可通過AMPK/ERK/TSC2/mTOR途徑誘導(dǎo)細(xì)胞自噬以促進(jìn)自身復(fù)制,但激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)的分子機(jī)制尚待進(jìn)一步揭示。本研究旨在闡明：(1)PCV2感染PK-15細(xì)胞激活A(yù)MPK的分子機(jī)制；(2)PCV2感染PK-15細(xì)胞除激活A(yù)MPK/ERK/TSC2/mTOR通路以外,是否有其它的自噬通路參與；(3) PCV2Cap蛋白誘導(dǎo)自噬的關(guān)鍵區(qū)域。1.PCV2感染PK-15細(xì)胞經(jīng)由CaMKKβ激活A(yù)MPK利用RNA干擾、免疫印跡、激光共聚焦及實(shí)時(shí)熒光定量PCR (q-RT-PCR)等方法對PCV2感染PK-15細(xì)胞激活A(yù)MPK的分子機(jī)制進(jìn)行探究。免疫印跡結(jié)果表明,PCV2感染PK-15細(xì)胞后24 h開始顯著上調(diào)鈣/鈣調(diào)素依賴的蛋白激酶的激酶β(CaMKKB )(1.00 vs 2.20, P 0.05),激活其底物分子AMPK(1.00 vs 2.59,P0.01)和鈣調(diào)蛋白激酶I(CaMKI) (1.00 vs 2.37, P 0.05); CaMKKβ抑制劑STO-609或特異性小干擾RNA (siCaMKKβ)均能顯著抑制PCV2誘導(dǎo)的MPK和CaMKI的活化。激光共聚焦結(jié)果顯示,STO-609或siCaMKKβ均能顯著抑制PCV2誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)自噬小體的形成(14.6 vs 28.5, P 0.01; 19.2 vs 29.0, P 0.01); q-RT-PCR及病毒滴度測定顯示,抑制CaMKKp (STO-609或siCaMKKβ)均能顯著降低子代PCV2 DNA拷貝數(shù)(106.02 vs 108.23; 106.91 vs 1O8.36, P0.01)及病毒滴度(TCID50) (10-2.23 vs 10-4.56, P 0.01; 10-285 vs 10-4.35, P 0.01)。這些結(jié)果表明,PCV2感染PK-15細(xì)胞經(jīng)由CaMKKβ激活A(yù)MPK及其下游通路誘導(dǎo)細(xì)胞自噬。2.PCV2感染PK-15細(xì)胞激活CaMKKβ/CaMKI/WOPIl自噬通路利用RNA干擾、免疫印跡、激光共聚焦及q-RT-PCR等技術(shù)對PCV2感染PK-15細(xì)胞是否激活CaMKK(3/CaMKI/WIPIl自噬通路進(jìn)行探究。結(jié)果顯示,PCV2感染后12 h便能顯著上調(diào)與磷酸肌醇互作的色氨酸-天冬氨酸重復(fù)蛋白1(WIPI1)的mRNA(1.00 vs 2.60, P 0.01)及其蛋白水平(1.00 vs 1.92,P0.05),而特異性小干擾RNA siWIP1l或siCaMKI以及CaMKI抑制劑KN93均能顯著抑制PCV2的復(fù)制及其誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬。此外,siAMPK能夠抑制PCV2誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬,但不影響CaMKI活化和WIPI1上調(diào)。激光共聚焦結(jié)果顯示,PCV2感染能夠促進(jìn)DsRed-WIPIl點(diǎn)狀聚集(47.0 vs 24.5,P0.01)及DsRed-WIPIl/EGFP-LC3共定位(16.7 vs 8.7,P0.01),這種促進(jìn)作用能被STO-609或KN93緩解。以上結(jié)果表明,PCV2感染能夠激活CaMKKβ/CaMKI/WIPI 1通路誘導(dǎo)自噬,且不依賴于AMPK。3.PCV2感染PK-15細(xì)胞經(jīng)由IP3R-Ca2+途徑激活CaMKKβ利用免疫印跡、ELISA和流式細(xì)胞術(shù)等技術(shù)進(jìn)一步探究PCV2感染激活CaMKKβ以及Cap蛋白誘導(dǎo)自噬的分子機(jī)制。基于流式細(xì)胞術(shù)和熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)方法的細(xì)胞漿Ca2+檢測顯示,PCV2感染后36 h能顯著上調(diào)胞漿游離Ca2+水平(128.7% vs 100%,P0.01),并顯著提高TN-XXL蛋白的FRET發(fā)生效率(14.1% vs 2.0%,P0.01)。這種上調(diào)作用能被三磷酸肌醇受體(IP3R)抑制劑2-APB緩解。免疫印跡顯示,2-APB能夠抑制PCV2感染對CaMKKβ/AMPK和CaMKKβ/CaMKI自噬通路的激活以及PCV2復(fù)制,而PCV2感染并未激活磷酯酶C-γ (PLC-γ)ELISA顯示PCV2感染未上調(diào)細(xì)胞內(nèi)三磷酸肌醇(IP3)水平,說明PCV2激活I(lǐng)P3R不是經(jīng)由PLC-IP3途徑。Cap及其截短表達(dá)載體(pCap、pCap1-100aa、pNLS+Cap90-190aa及pNLS+Cap185-233aa)轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞均能不同程度的上調(diào)細(xì)胞漿內(nèi)Ca2+水平,并誘導(dǎo)自噬,且與Cap蛋白的核定位信號(Cap1-41 aa, NLS)無關(guān),Cap蛋白的aa42-185可能起主要作用。此外,Cap及其截短表達(dá)不能誘導(dǎo)HEK293細(xì)胞發(fā)生自噬。以上結(jié)果表明,PCV2感染PK-15細(xì)胞經(jīng)由Cap蛋白通過IP3R-Ca2+途徑激活CaMKKβ。綜上所述,本研究進(jìn)一步闡明了PCV2感染誘導(dǎo)PK-15細(xì)胞自噬的分子機(jī)制：(1)PCV2感染經(jīng)由CaMKKβ激活A(yù)MPK及其下游通路誘導(dǎo)PK-15細(xì)胞自噬；(2)PCV2感染也可以激活CaMKKβ/CaMKI/WIIPI1自噬通路,且不依賴于AMPK;(3)PCV2通過Cap蛋白經(jīng)由IP3R-Ca2+途徑激活CaMKKβ誘導(dǎo)自噬。研究結(jié)果為詮釋PCV2的致病機(jī)理及抗PCV2藥物的研發(fā)提供了基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S852.651

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