本文關(guān)鍵詞：海洋細(xì)菌來源的功能蛋白對(duì)海洋中重要有機(jī)物的識(shí)別及催化機(jī)制　出處：《山東大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：微生物在海洋氮循環(huán)和海洋硫循環(huán)中發(fā)揮著重要作用。肽類物質(zhì)的攝取是海洋微生物攝取營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)過程的重要組成部分。海洋細(xì)菌對(duì)肽類物質(zhì)的攝取也是海洋氮循環(huán)過程的重要一環(huán)。三甲胺(TMA)和氧化三甲胺(TMAO)是海洋細(xì)菌的重要氮源。細(xì)菌在胞內(nèi)利用TMA單加氧酶將TMA氧化為IMAO。海洋中二甲基巰基丙酸內(nèi)鹽(DMSP)的產(chǎn)量非常大,全球每年約有109噸的DMSP產(chǎn)生。海洋細(xì)菌利用胞內(nèi)的DMSP裂解酶裂解DMSP產(chǎn)生二甲基硫(DMS)。DMS是全球硫循環(huán)的重要參與者,DMS的氧化產(chǎn)物可以影響全球氣候。在本論文中,我們主要對(duì)海洋氮循環(huán)和硫循環(huán)中重要生理過程的分子機(jī)制進(jìn)行研究,包括研究海洋細(xì)菌對(duì)二肽的識(shí)別機(jī)制、對(duì)TMAO的識(shí)別機(jī)制、氧化TMA生成TMAO的分子機(jī)制、以及裂解DMSP生成DMS的分子機(jī)制。一、海洋細(xì)菌對(duì)二肽的多重特異性識(shí)別機(jī)制研究肽類物質(zhì)的攝取是海洋細(xì)菌的一個(gè)重要生理過程,也是海洋氮循環(huán)過程的重要一環(huán)。然而,海洋細(xì)菌攝取肽類物質(zhì)的分子機(jī)制尚不是十分清楚。二肽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)(Dpp)是細(xì)菌中一個(gè)重要的轉(zhuǎn)運(yùn)肽類物質(zhì)的ABC型轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng),主要負(fù)責(zé)二肽的轉(zhuǎn)運(yùn)。DppA是Dpp轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)中位于周質(zhì)空間的底物結(jié)合蛋白,DppA的底物特異性決定了Dpp的底物特異性。在本論文研究中,我們用等溫滴定量熱儀分析了來源自深海細(xì)菌Pseudoalteromonas sp. SM9913的DppA (PsDppA)對(duì)25種不同二肽的底物特異性。PsDppA對(duì)其中的8種二肽展現(xiàn)出高親和力。為了闡明PsDppA的多重特異性底物識(shí)別機(jī)制,我們解析了不結(jié)合底物的PsDppA的晶體結(jié)構(gòu)和結(jié)合有4種不同底物(Ala-Phe、Met-Leu、Gly-Glu和Val-Thr)的PsDppA復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)。在底物結(jié)合前后,PsDppA會(huì)由“開放”狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)椤伴]合”狀態(tài)。對(duì)4種PsDppA與底物復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)分析和突變分析表明,PsDppA在結(jié)合底物時(shí)采用十分精確的機(jī)制：PsDppA主要依靠其氨基酸殘基與二肽底物主鏈的相互作用結(jié)合二肽分子,尤其是PsDppA與二肽底物間的鹽橋相互作用；疏水相互作用在PsDppA結(jié)合疏水性較強(qiáng)的二肽時(shí)起到重要作用；氨基酸殘基Lys457對(duì)PsDppA結(jié)合C末端氨基酸為谷氨酸或谷氨酰胺的二肽時(shí)發(fā)揮關(guān)鍵作用。序列比對(duì)表明,革蘭氏陰性細(xì)菌的二肽底物識(shí)別機(jī)制與PsDppA的底物識(shí)別機(jī)制是相似的�？偟膩碚f,我們的研究結(jié)果為海洋革蘭氏陰性細(xì)菌多重特異性二肽底物識(shí)別機(jī)制提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ),有助于我們更好地理解海洋細(xì)菌攝取肽類物質(zhì)的生理過程。二、海洋細(xì)菌對(duì)TMAO的識(shí)別機(jī)制研究TMAO是海洋細(xì)菌的一種重要的氮源。海洋中的TMAO能被海洋細(xì)菌代謝為揮發(fā)性的甲基胺類物質(zhì),這些揮發(fā)性的甲基胺類物質(zhì)是溫室效應(yīng)氣體一氧化二氮的前體物質(zhì)。然而,微生物識(shí)別和轉(zhuǎn)運(yùn)TMAO的分子機(jī)制到目前為止并不清楚。海洋玫瑰桿菌屬細(xì)菌Ruegeria pomeroyi DSS-3中有一個(gè)特異性轉(zhuǎn)運(yùn)TMAO的ABC型轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)：TmoXWV。TmoX是TmoXWV轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)中位于周質(zhì)空間的底物結(jié)合蛋白。在本論文研究中,我們分析了TmoX的底物特異性,重組表達(dá)的TmoX在體外展現(xiàn)出對(duì)TMAO很強(qiáng)的親和力。我們進(jìn)一步解析了TmoX/TMAO復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)。通過生化分析、結(jié)構(gòu)分析和突變分析,我們揭示了TmoX結(jié)合TMAO的分子機(jī)制。TmoX的晶體結(jié)構(gòu)中含有一個(gè)Ca2+,生化分析表明這個(gè)Ca2+在維持TmoX蛋白穩(wěn)定性方面發(fā)揮著重要作用。分子動(dòng)力學(xué)模擬實(shí)驗(yàn)表明,在底物結(jié)合前后,TmoX會(huì)由“開放”狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)椤伴]合”狀態(tài)。在TmoX的底物結(jié)合腔中,四個(gè)色氨酸殘基的吲哚環(huán)與TMAO分子形成cation-π相互作用,氨基酸殘基Glu131與TMAO的極性氧原子形成一個(gè)氫鍵。除此之外,TmoX底物結(jié)合腔中苯丙氨酸的側(cè)鏈與色氨酸側(cè)鏈之間形成的π-π堆積相互作用也對(duì)TmoX結(jié)合TMAO是必需的。序列分析表明海洋細(xì)菌,尤其是海洋玫瑰桿菌屬的細(xì)菌,識(shí)別TMAO的機(jī)制與本論文中提出的TmoX識(shí)別TMAO的分子機(jī)制是相似的。我們的結(jié)果有助于更好地理解海洋細(xì)菌攝取TMAO的生理過程。三、海洋細(xì)菌氧化TMA生成TMAO的分子機(jī)制研究TMA和TMAO在海洋中廣泛存在,它們都是海洋細(xì)菌的重要氮源物質(zhì)。細(xì)菌中的黃素單加氧酶(FMO)被稱為Tmm,Tmm能夠氧化TMA生成TMAO。編碼Tmm的基因在海洋細(xì)菌中豐度很高。Tmm在海洋碳循環(huán)和氮循環(huán)中發(fā)揮著重要作用。然而,Tmm氧化TMA的分子機(jī)制尚不清楚。在本論文研究中,我們測(cè)定了來源白海洋細(xì)菌Roseovarius nubinhibens ISM的Tmm的基本酶學(xué)性質(zhì),其最適酶活溫度為30℃,最適酶活pH為8.0。進(jìn)一步,我們解析了Tmm/FAD/NADPH復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)、失活突變體Tyr207Ser/FAD/NADPH復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)和高濃度TMA浸泡處理的Tyr207Ser/FAD/NADPH復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)。Tmm的催化過程可以分為兩個(gè)半反應(yīng)：還原半反應(yīng)和氧化半反應(yīng)。結(jié)構(gòu)分析顯示在氧化半反應(yīng)中,Tmm結(jié)構(gòu)中的NADP+分子能夠產(chǎn)生構(gòu)象變化,與Tmm的氨基酸殘基Asp317形成一個(gè)新的氫鍵,NADP+的這種構(gòu)象變化導(dǎo)致了兩個(gè)結(jié)果：一是關(guān)閉底物進(jìn)入通道,為催化反應(yīng)創(chuàng)造一個(gè)受保護(hù)的微環(huán)境；二是將Tmm被激活的催化中心暴露給TMA,完成催化反應(yīng)。這是NADP+分子在催化反應(yīng)的整個(gè)過程中始終結(jié)合在Tmm上的第一個(gè)結(jié)構(gòu)證據(jù)。結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果,我們提出了Tmm催化TMA產(chǎn)生TMAO的分子機(jī)制。序列分析表明我們提出的Tmm的催化機(jī)制在細(xì)菌中是普遍存在的,尤其是在海洋玫瑰桿菌屬和SAR1l類群的細(xì)菌中。我們的結(jié)果進(jìn)一步闡明了FMO類蛋白的催化機(jī)制,也有助于更好地理解海洋細(xì)菌參與的海洋碳循環(huán)和氮循環(huán)機(jī)制。四、海洋細(xì)菌裂解DMSP生成DMS的分子機(jī)制研究微生物通過DMSP裂解酶裂解DMSP產(chǎn)生揮發(fā)性的DMS,該反應(yīng)在全球硫循環(huán)和碳循環(huán)中發(fā)揮著重要的作用。DMS在從海洋揮發(fā)到大氣中后,會(huì)被氧化,其氧化產(chǎn)物能參與云凝結(jié)核的形成,進(jìn)而可能影響全球的氣候。目前,有6種來源于不同微生物的DMSP裂解酶的基因得到鑒定,但這些酶催化DMSP裂解的分子機(jī)制尚不清楚。DMSP裂解酶DddQ的編碼基因是在海洋宏基因組數(shù)據(jù)庫中含量最多的DMSP裂解酶基因之一。在本論文中,我們探究了細(xì)菌Ruegeria lacuscaerulensis ITI_1157中一種DMSP裂解酶(DddQ)裂解DMSP的分子機(jī)制。我們首先檢測(cè)了DddQ的基本酶學(xué)性質(zhì),DddQ的最適酶活溫度為30℃,最適酶活pH為8.0。Mn2+和Co2+對(duì)DddQ的酶活有顯著的促進(jìn)作用,而Zn2+則幾乎完全抑制了DddQ的酶活。隨后,我們解析了DddQ結(jié)合抑制劑的晶體結(jié)構(gòu)以及DddQ的失活突變體TyrB1Ala結(jié)合DMSP的晶體結(jié)構(gòu)。結(jié)構(gòu)分析表明,DddQ采用p桶式折疊方式,其活性中心螯合一個(gè)Zn2+,并有六個(gè)高度保守的氨基酸殘基(Tyr120、His123、His125、Glu129、Tyr131和His163)。突變體的生化實(shí)驗(yàn)分析顯示這些氨基酸殘基是催化所必需的。值得注意的是,氨基酸殘基Tyr131在催化過程中作為催化堿,通過構(gòu)象變化發(fā)動(dòng)親核攻擊,引發(fā)DMSP裂解反應(yīng)這個(gè)典型的p消除反應(yīng)。結(jié)構(gòu)分析和分子動(dòng)力學(xué)模擬顯示,在DddQ的底物結(jié)合腔上方,有兩個(gè)柔性較強(qiáng)的卷曲能在“開放”和“關(guān)閉’狀態(tài)間轉(zhuǎn)換,對(duì)DMSP的進(jìn)入起到門控作用。綜合實(shí)驗(yàn)結(jié)果,我們提出了DddQ催化DMSP裂解產(chǎn)生DMS的分子機(jī)制。本研究首次揭示了DMSP裂解為DMS的分子機(jī)制,有助于我們更好地理解這個(gè)重要的生物地球化學(xué)反應(yīng)�？偠灾�,本論文研究了在海洋有機(jī)氮和有機(jī)硫循環(huán)中幾個(gè)重要生理過程的生物化學(xué)機(jī)制,有助于我們更好地理解海洋氮循環(huán)和硫循環(huán)的過程。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：Q936
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本文編號(hào)：1325942