本文關(guān)鍵詞：五元角環(huán)多酚類化合物的基因組挖掘　出處：《東北農(nóng)業(yè)大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：五元角環(huán)多酚是由24-30個(gè)碳的聚酮鏈前體形成的芳香類化合物,因其中的五元角環(huán)核心結(jié)構(gòu)而得名。這一類具有復(fù)雜多變結(jié)構(gòu)和多種多樣活性的芳香類天然產(chǎn)物,在醫(yī)藥領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景。本研究的目的在于通過基因組挖掘的手段,從放線菌這一重要的天然產(chǎn)物產(chǎn)生者中發(fā)現(xiàn)新的五元角環(huán)多酚類化合物。論文包含兩個(gè)部分內(nèi)容:一是通過對Streptosporangium sp.CGMCC 4.7309的全基因組測序,結(jié)合生物信息學(xué)分析來發(fā)掘其中的五元角環(huán)多酚;二是使用基于同源性的PCR篩選策略,從不同來源的放線菌中篩選具有產(chǎn)生五元角環(huán)多酚潛力的菌株,進(jìn)一步獲得各種新結(jié)構(gòu)的五元角環(huán)多酚。NCBI公開的基因組數(shù)據(jù)顯示鏈孢囊菌(Streptosporangium)具有很強(qiáng)的生產(chǎn)次級代謝產(chǎn)物的潛力,因此本研究選擇Streptosporangium sp.CGMCC 4.7309進(jìn)行全基因組測序。使用antiSMASH分析了S.sp.CGMCC 4.7309的基因組序列,結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中包含超過20個(gè)次級代謝產(chǎn)物基因簇,并從中找到了可能參與合成五元角環(huán)多酚的II型聚酮合酶基因簇,該基因簇包含33個(gè)開放閱讀框。將該基因簇的各個(gè)基因所編碼的蛋白進(jìn)行在線BLAST比對,并對它們的功能進(jìn)行了預(yù)測。通過系統(tǒng)進(jìn)化樹分析其中的KSβ與已知五元角環(huán)多酚基因簇中的同源蛋白,推測了五元角環(huán)多酚的骨架長度含有26個(gè)碳原子。多重序列比對分析了可能影響框架結(jié)構(gòu)的Baeyer-Villiger氧化酶Hex18和天冬酰胺合成酶Hex6的活性位點(diǎn),并且對基因簇產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了預(yù)測。本論文首次建立了鏈孢囊菌-大腸桿菌的遺傳轉(zhuǎn)化體系,并基因敲除了五元角環(huán)多酚合成起始階段重要的酮基還原酶Hex30,通過比較基因敲除菌株和野生型菌株的代謝譜找到了該基因簇所對應(yīng)的五元角環(huán)多酚類化合物。經(jīng)過分離純化得到了3個(gè)化合物,分別為hexaricin A、hexaricin B和新化合物hexaricin C。通過LC-MS和NMR分析確定了hexaricins平面結(jié)構(gòu),并通過理論計(jì)算與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)(比旋光度和圓二色譜)比較確定了3個(gè)化合物的絕對構(gòu)像。依賴同源性的PCR篩選策略在天然產(chǎn)物產(chǎn)生菌的基因組挖掘上已經(jīng)取得了巨大的成功。五元角環(huán)多酚由II型聚酮合酶合成,之前的篩選體系所采用的探針以聚酮合酶中的酮基合酶基因KSβ為靶點(diǎn),不能特異性地篩選出具有產(chǎn)生五元角環(huán)多酚潛力的菌株。對已報(bào)道的五元角環(huán)多酚基因簇研究發(fā)現(xiàn),在五元角環(huán)多酚基因簇中存在2個(gè)特異的單加氧酶編碼基因,因此,該基因可以作為靶點(diǎn)設(shè)計(jì)探針,通過進(jìn)行PCR篩選策略可特異性篩選出五元角環(huán)多酚產(chǎn)生菌。通過對單加氧酶同源蛋白的多重序列比對,實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了6對簡并引物,并以其中的3對引物對318株放線菌進(jìn)行PCR篩選,共獲得14個(gè)陽性菌株,其中的1對引物對篩選出的14個(gè)菌株均呈陽性結(jié)果,具有較好的篩選效果。選取其中的3株陽性菌株Streptomyces champavatii CGMCC 4.1615、Streptomyces sp.1.093和Streptomyces sp.B81進(jìn)行基因組測序,分析發(fā)現(xiàn)在這3株菌種都含有五元角環(huán)多酚基因簇,結(jié)果證明了此方法的可靠性。菌株4.1615的五元角環(huán)多酚基因簇含有32個(gè)開放閱讀框,而鏈霉菌1.093和B81的五元角環(huán)多酚基因簇都含有55個(gè)開放閱讀框。使用在線BLAST推測了各基因的功能,結(jié)果顯示菌株4.1615中的五元角環(huán)多酚基因簇與fredericamycin的基因簇幾乎一致;菌株1.093和B81中的五元角環(huán)多酚基因簇與xantholipin基因簇具有較高的相似性,進(jìn)化樹分析和多重序列比對顯示它們可能生物合成xantholipin結(jié)構(gòu)類似物。在菌株B81中,五元角環(huán)多酚基因簇處于沉默狀態(tài),通過將基因簇中的正調(diào)控基因cds12過表達(dá),激活了該基因簇的表達(dá),并產(chǎn)生了五元角環(huán)多酚類化合物。使用ISP3培養(yǎng)基發(fā)酵,經(jīng)過丙酮浸提,乙酸乙酯萃取,硅膠柱層析得到了純度較高的目標(biāo)化合物,該化合物的結(jié)構(gòu)鑒定還在進(jìn)行中。
【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：Q78

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