本文關(guān)鍵詞：碳離子輻射誘變白花紫露草突變體葉色變化機(jī)理研究　出處：《甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：葉色突變體是研究高等植物光合系統(tǒng)結(jié)構(gòu)、葉綠素代謝、葉綠體發(fā)育、光合作用及激素生理等一系列生理代謝過程的理想材料,也是遺傳和育種研究中的重要材料。本研究利用碳離子輻照技術(shù),對(duì)野生型白花紫露草(Wild type,WT)幼嫩枝條進(jìn)行輻照處理,并篩選得到可穩(wěn)定遺傳的溫敏型葉色突變體(mutant,mt),該突變體的葉色隨溫度的降低由綠色逐漸變?yōu)榉凵?隨著溫度升高粉色又逐漸褪去,直至變?yōu)樯罹G色。本研究以此突變體為材料,通過對(duì)不同溫度環(huán)境下白花紫露草野生型和突變體表型觀察、細(xì)胞水平檢測(cè)、光合特性研究、色素成分分析以及花青素合成途徑關(guān)鍵基因的差異表達(dá)分析,探討白花紫露草葉色突變的物質(zhì)基礎(chǔ)和理化因素;利用RNA-Seq轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)對(duì)不同溫度下的野生型和葉色突變體進(jìn)行基因組分析,構(gòu)建白花紫露草unigene庫及公共信息平臺(tái),破譯不同溫度下對(duì)照與突變體的關(guān)鍵基因,預(yù)測(cè)溫度變化引起突變體葉色變化的相關(guān)基因,探究因輻照引起的白花紫露草葉色隨溫度變化的代謝途徑,闡明重離子誘導(dǎo)白花紫露草葉色隨溫度變化的機(jī)理,并為后續(xù)相關(guān)基因的功能驗(yàn)證以及重離子誘變選育葉色突變體提供理論基礎(chǔ)。研究結(jié)果如下:(1)以不同劑量的碳離子束輻照白花紫露草幼嫩枝條后,在20Gy劑量下篩選到一株莖桿變?yōu)樽仙�、葉片隨溫度降低呈粉色斑塊、且斑塊大小與顏色深淺隨溫度發(fā)生變化的突變體。在不同溫度環(huán)境下,mt的葉色、葉長(zhǎng)、葉寬、葉面積以及葉片含水量等葉片參數(shù)較WT均發(fā)生了變化;經(jīng)流式細(xì)胞儀對(duì)染色體數(shù)目進(jìn)行鑒定分析發(fā)現(xiàn),與WT相比,其染色體倍性并未發(fā)生改變。(2)對(duì)不同溫度下的白花紫露草WT和mt的葉片解剖結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn):在光學(xué)顯微鏡下,在7℃環(huán)境下,mt-7℃葉片的下表皮積累大量的紫色花青素,且在維管組織和海綿組織中也觀察到少量的花青素積累;mt-25℃環(huán)境下,mt葉片中海綿組織和維管組織的花青素消失,僅葉片下表皮有少量的花青素分布;在WT中僅觀察到大量的葉綠素,并未觀察到其他色素成分。在掃描電鏡下,不同溫度環(huán)境下,mt葉片上表皮細(xì)胞形態(tài)差異不顯著,但是下表皮分布的氣孔差異顯著。在透射電鏡下,WT可以觀察到成熟完整的葉綠體;mt-25℃葉片葉綠體結(jié)構(gòu)模糊,隨著溫度的降低,mt-7℃葉片中白色體代替了葉綠體。(3)對(duì)不同溫度環(huán)境下的mt葉片的色素含量、葉綠素?zé)晒鈪?shù)及光合作用關(guān)鍵酶進(jìn)行了測(cè)定分析。結(jié)果表明:在7℃環(huán)境下,與WT相比,mt-7℃葉片中葉綠素含量和類胡蘿卜素含量分別降低了45%和94%,花青素含量較WT增高了21倍;mt-7℃葉片的比活性參數(shù)ABS/RC、TRO/RC、ETO/RC均顯著高于WT;FV/FM、PIABS、φEO以及φO均顯著低于WT;除PEPCase外,其余兩種光合作用的關(guān)鍵酶活性均顯著低于野生型。隨著溫度的升高,mt-25℃葉片葉綠素含量和類胡蘿卜素含量與WT之間無顯著差異,但花青素含量升高了50%;在葉綠素?zé)晒鈪?shù)方面,mt-25℃的FV/FM和PIABS值顯著低于WT外,其余各項(xiàng)參數(shù)指標(biāo)與WT之間無顯著差異;mt-25℃葉片的三種光合作用關(guān)鍵酶活性也隨溫度升高而增加。(4)利用HPLC對(duì)花青素和黃酮的成分和含量進(jìn)行測(cè)定。在WT中未檢測(cè)到任何花青素成分。與WT相比,在不同溫度條件下,mt葉片中均檢測(cè)到矢車菊素、矮牽牛素、飛燕草素三種花青素成分,天竺葵素僅在mt-7℃葉片中存在,但是在mt-25℃葉片中各花青素的含量均顯著低于mt-7℃的含量,進(jìn)一步證實(shí)了由于花青素含量的下降以及成分的變化引起其葉色恢復(fù)為綠色。(5)花青素合成途徑關(guān)鍵基因的q RT-RCR結(jié)果顯示,mt-7℃葉片中花青素合成途徑的結(jié)構(gòu)基因(PAL、CHS、CHI、F3H、F3’H、F3’5’H、DFR、ANS、UFGT、OMT)和轉(zhuǎn)錄因子(R2R3-MYB和WD40)的表達(dá)量均極顯著高于WT;隨著溫度升高,mt-25℃結(jié)構(gòu)基因PAL、CHS和ANS表達(dá)量下調(diào),且與WT表達(dá)量差異不顯著,這三種基因的下調(diào),阻斷了花青素的合成,是其葉色恢復(fù)為綠色的因素之一。(6)通過RNA-Seq轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,獲得了白花紫露草轉(zhuǎn)錄組unigenes數(shù)據(jù)庫,測(cè)序共組裝獲得91565條unigenes,其中功能注釋了44733條unigenes。WT較mt-7℃樣品組、WT較mt-25℃樣品組以及mt-25℃較mt-7℃樣品組分別檢測(cè)到15368、12401和6456條差異表達(dá)基因。KEGG pathway分析結(jié)果顯示,差異基因主要集中在卟啉和葉綠素合成代謝途徑、光合作用代謝、光合作用天線蛋白以及花青素合成途徑。另外對(duì)7個(gè)花青素合成途徑的unigenes和10個(gè)葉綠素合成途徑的unigenes進(jìn)行了q RT-PCR驗(yàn)證,其結(jié)果與RNA-Seq的數(shù)據(jù)一致,mt-7℃葉片中主要表現(xiàn)為花青素合成途徑unigenes的表達(dá)量上調(diào)和葉綠素合成途徑的unigenes表達(dá)量下調(diào)造成其葉色呈現(xiàn)粉色。而mt-25℃葉片中,部分葉綠素合成途徑的unigenes表達(dá)量上調(diào)(如POR)以及花青素合成途徑下游基因ANS表達(dá)量的上調(diào)造成其葉色較WT深,且背部呈現(xiàn)淡紫色。
【學(xué)位授予單位】：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：Q945

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本文編號(hào)：1323217