本文關(guān)鍵詞：番茄葉綠體DnaJ蛋白SlCDJ2的功能分析　出處：《山東農(nóng)業(yè)大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：番茄是一種起源于熱帶的喜溫蔬菜作物,但其對(duì)高溫的抗性并不強(qiáng),而高溫通常伴隨著干旱,這兩種脅迫嚴(yán)重時(shí)會(huì)使番茄結(jié)實(shí)率低下,造成減產(chǎn)。因此,研究番茄的高溫、干旱抗性具有重要的科學(xué)意義和應(yīng)用價(jià)值。另外,番茄在環(huán)境變化時(shí),又極易染病,嚴(yán)重時(shí),造成番茄果實(shí)大面積腐爛,減產(chǎn)。同樣,對(duì)番茄抗病性的研究也具有現(xiàn)實(shí)意義。當(dāng)植物遭受逆境脅迫時(shí),細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)內(nèi)穩(wěn)態(tài)遭到破壞,產(chǎn)生大量活性氧(ROS),光合作用受到抑制。Dna J蛋白作為一種廣泛的脅迫響應(yīng)因子,它具有獨(dú)自或協(xié)助Hsp70完成蛋白質(zhì)折疊、解折疊、聚合和調(diào)節(jié)蛋白復(fù)合物解聚等功能,在逆境脅迫下蛋白質(zhì)或蛋白復(fù)合體穩(wěn)定性的維持方面發(fā)揮重要作用。因此,研究逆境脅迫下番茄Dna J蛋白的功能,具有非常重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。本研究克隆了一個(gè)番茄葉綠體定位的Dna J蛋白基因(SlCDJ2),并以轉(zhuǎn)正、反義SlCDJ2的番茄和過(guò)表達(dá)SlCDJ2的煙草為材料,探討了轉(zhuǎn)SlCDJ2基因番茄在高溫脅迫下維持Rubisco活性和轉(zhuǎn)SlCDJ2基因煙草在干旱和病原菌脅迫下ROS清除能力等方面的功能,主要結(jié)果如下:(1)從番茄葉片中分離得到SlCDJ2(Gen Bank序列號(hào):AK323942.1),該基因全長(zhǎng)為1159bp,開(kāi)放閱讀框?yàn)?34bp,編碼277個(gè)氨基酸。預(yù)測(cè)分子量為32.7k Da,等電點(diǎn)為9.30。該基因位于番茄12號(hào)染色體上。(2)RT-qPCR分析發(fā)現(xiàn),SlCDJ2在番茄的根、莖、葉、花和果中均有表達(dá),其中在葉片中的表達(dá)量最高,同時(shí),高溫、干旱、SA和病原菌均可誘導(dǎo)SlCDJ2表達(dá)。經(jīng)過(guò)western blot進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),SlCDJ2明顯受到42°C的誘導(dǎo)表達(dá)。(3)構(gòu)建SlCDJ2-GFP融合蛋白,并瞬時(shí)轉(zhuǎn)化擬南芥原生質(zhì)體,通過(guò)Confocal觀察發(fā)現(xiàn)SlCDJ2蛋白定位于葉綠體。Western blot結(jié)果進(jìn)一步顯示SlCDJ2蛋白均勻地分布在葉綠體基質(zhì)和類囊體膜上。(4)構(gòu)建了pET-SlCDJ2原核表達(dá)載體,成功誘導(dǎo)SlCDJ2在大腸桿菌BL21中表達(dá),并將誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白質(zhì)純化后免疫小鼠,制備抗體,測(cè)得效價(jià)為1:10000,用于接下來(lái)的western blot實(shí)驗(yàn)。(5)酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明SlCDJ2可以與番茄葉綠體定位的cp Hsp70互作。(6)將SlCDJ2的編碼區(qū)連入p BI121載體,構(gòu)建了SlCDJ2的過(guò)表達(dá)和抑制表達(dá)載體。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法轉(zhuǎn)化番茄,獲得正、反義轉(zhuǎn)基因番茄植株,同時(shí),將過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)入煙草中,獲得過(guò)表達(dá)SlCDJ2煙草植株。并通過(guò)PCR、q RT-PCR以及western雜交的方法檢測(cè)具有卡那抗性的轉(zhuǎn)基因植株,結(jié)果表明成功獲得了SlCDJ2過(guò)表達(dá)和抑制表達(dá)的轉(zhuǎn)基因番茄植株和轉(zhuǎn)基因煙草植株。(7)高溫脅迫下,過(guò)表達(dá)SlCDJ2番茄具有較高的CO2同化速率、Rubisco活性和Rubisco大亞基含量。RT-q PCR分析發(fā)現(xiàn)高溫處理后,衰老誘導(dǎo)表達(dá)的幾個(gè)基因(SENU3、Sl SGR1、LX、Rbc L、Rbc S、Psb A)在轉(zhuǎn)基因和WT番茄中均發(fā)生了相應(yīng)的上調(diào)和下調(diào)表達(dá)。此外,蛋白水解酶活性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)高溫處理后,反義植株水解酶活性明顯高于WT和正義植株,說(shuō)明SlCDJ2可能通過(guò)維持較低的蛋白水解酶活性來(lái)緩解Rubisco的降解速度,進(jìn)而緩解光合作用所受的抑制。(8)在干旱脅迫下,過(guò)表達(dá)SlCDJ2能減少轉(zhuǎn)基因煙草H2O2和O2·-的積累。與Vec植株相比,轉(zhuǎn)基因植株具有相對(duì)較高的最大光化學(xué)效率、凈光合速率和D1蛋白含量。因此,過(guò)表達(dá)SlCDJ2能夠增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)干旱的抗性。(9)用青枯假單胞菌侵染轉(zhuǎn)基因煙草和Vec植株后,病原菌對(duì)轉(zhuǎn)基因植株的傷害程度明顯小于Vec植株。無(wú)論過(guò)氧化氫染色還是臺(tái)盼藍(lán)染色,均說(shuō)明轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)病原菌的抗性強(qiáng)于Vec植株。通過(guò)對(duì)抗病基因的RT-q PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn),PR1a和PR2基因在轉(zhuǎn)基因植株中表達(dá)量明顯高于Vec植株,這說(shuō)明SlCDJ2參與了抗病響應(yīng),且過(guò)表達(dá)SlCDJ2增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因煙草的病原菌抗性。
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：Q943.2

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本文編號(hào)：1322106