本文關(guān)鍵詞：豬繁殖與呼吸綜合征病毒Nsp9蛋白納米抗體的篩選及其抗病毒功能研究　出處：《西北農(nóng)林科技大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由PRRS病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的病毒性傳染病,該病在臨床上主要引起母豬流產(chǎn)以及各年齡段豬的呼吸道疾病,給全球養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。由于PRRSV具有高變性和抗體依賴的增強(qiáng)作用,現(xiàn)有的疫苗并不能給豬群提供完全的保護(hù)作用,因此有必要嘗試研發(fā)新型抗病毒策略。PRRSV的非結(jié)構(gòu)蛋白9(Nonstructural protein 9,Nsp9)具有RNA依賴的RNA聚合酶(RNAdependent RNA plolymerase,RdRp)活性,在病毒生命周期中發(fā)揮重要作用,并且與其他病毒蛋白相比Nsp9具有更高的保守性,是研發(fā)抗PRRSV藥物的理想靶蛋白。納米抗體(nanobody)具有分子量小、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、可溶性好、特異性強(qiáng)、生產(chǎn)成本低以及可以識別特殊抗原表位等優(yōu)點(diǎn)。目前已有針對多種人類病毒納米抗體的研究報(bào)道,結(jié)果顯示具有良好的抗病毒活性和臨床應(yīng)用前景,然而在動(dòng)物病毒上相關(guān)的研究報(bào)道還比較少�；谝陨媳尘�,本研究利用噬菌體展示技術(shù)篩選針對PRRSV Nsp9的特異性納米抗體,探索其抗病毒活性和機(jī)制,為開發(fā)新型抗PRRSV的納米抗體藥物提供必要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和物質(zhì)基礎(chǔ)。本研究的主要內(nèi)容和結(jié)果如下:1.利用Overlap PCR擴(kuò)增Nsp9全長基因片段,將其克隆入pET-28a載體,構(gòu)建了pET-28a-Nsp9重組表達(dá)載體。將其轉(zhuǎn)化Transetta(DE3)感受態(tài)細(xì)胞,IPTG誘導(dǎo)后,經(jīng)SDS-PAGE和western blot分析表明Nsp9重組蛋白得到可溶性表達(dá)。經(jīng)過Ni-NTA親和層析柱和凝膠過濾層析柱兩步純化,得到具有較高純度的Nsp9重組蛋白。將其免疫BALB/c小鼠制備抗血清,血清ELISA效價(jià)可以達(dá)到1:1,000,000表明本實(shí)驗(yàn)制備的Nsp9重組蛋白具有較好的免疫原性。2.利用Nsp9重組蛋白結(jié)合弗氏佐劑免疫成年雄性阿拉善雙峰駝,經(jīng)過6次免疫后,駱駝血清中Nsp9特異性抗體的效價(jià)可以達(dá)到1:128,000。分離外周血淋巴細(xì)胞,提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄cDNA,利用巢式PCR擴(kuò)增VHH基因,將其連入pCANTAB 5E載體并轉(zhuǎn)化TG1感受態(tài)細(xì)胞,得到了庫容量為4×108的雙峰駝重鏈抗體可變區(qū)噬菌體展示文庫。經(jīng)過3輪淘選,共篩選到8株Nsp9特異性納米抗體,其中Nb6和Nb7具有較強(qiáng)的結(jié)合力。3.將納米抗體和Nsp9真核表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞,進(jìn)行免疫共沉淀實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明,細(xì)胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)的Nb6和Nb7具有結(jié)合Nsp9的活性。隨后將納米抗體真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染MARC-145細(xì)胞,利用加壓篩選和有限稀釋法,獲得了穩(wěn)定表達(dá)納米抗體的MARC-145細(xì)胞系。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)表明,胞內(nèi)納米抗體沒有細(xì)胞毒性。4.通過病毒感染實(shí)驗(yàn)研究了納米抗體的抗病毒功能。研究結(jié)果表明,胞內(nèi)表達(dá)的Nb6可以抑制多株P(guān)RRSV毒株(SD16、JX-A1、GD-HD、VR-2332)在MARC-145細(xì)胞中的增殖,并且在0.01 MOI或更低接毒量條件下,可以完全阻斷PRRSV SD16毒株的增殖。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn),胞內(nèi)表達(dá)的Nb6可以結(jié)合PRRSV編碼的Nsp9蛋白,并抑制病毒基因的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。綜上所述,本研究首次篩選到了PRRSV Nsp9蛋白特異性納米抗體,為Nsp9結(jié)構(gòu)和功能的研究提供有用的研究工具,其中納米抗體Nb6可以強(qiáng)烈地抑制多株P(guān)RRSV毒株在MARC-145中的復(fù)制,有望開發(fā)成為新型的抗PRRSV藥物。
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S852.65
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本文編號：1320528