發(fā)布時(shí)間：2017-12-21 23:02

  本文關(guān)鍵詞：脂肪干細(xì)胞微環(huán)境對衰老成纖維細(xì)胞作用及機(jī)制的研究　出處：《重慶醫(yī)科大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：皮膚的老化是人體衰老最突出的表現(xiàn)之一,減緩皮膚的衰老一直是人們追求的目標(biāo)。其中真皮成纖維細(xì)胞是皮膚中主要功能細(xì)胞之一,也是皮膚抗衰老的主要目標(biāo)細(xì)胞。脂肪干細(xì)胞(adipose-derived stem cells,ASCs)存在于成熟脂肪組織中,其含量豐富,提取簡便,供區(qū)易被患者接受,被認(rèn)為是有極大應(yīng)用前景的干細(xì)胞。多個(gè)研究證實(shí)脂肪干細(xì)胞據(jù)報(bào)道可旁分泌多種細(xì)胞因子,包括炎癥因子、血管源性因子、生長因子等等。這些細(xì)胞因子構(gòu)成了ASCs生長的微環(huán)境,通過多種途徑對周圍組織和細(xì)胞產(chǎn)生作用和影響。ASCs本身的分化數(shù)量相對較少,它們更像組織細(xì)胞活動(dòng)的組織者,而不是參與者。有許多研究表明ASCs生物活性的生長因子可與周圍組織和細(xì)胞進(jìn)行信號傳導(dǎo),并表現(xiàn)出對傷口愈合,組織修復(fù)和抗衰老的積極作用。但ASCs微環(huán)境對成纖維細(xì)胞的長時(shí)間作用尚未見報(bào)道。ASCs微環(huán)境是否會(huì)改變成纖維細(xì)胞的衰老狀態(tài),通過何種機(jī)制改變,這些問題都尚不清楚。細(xì)胞的衰老本身也是細(xì)胞的一種自我保護(hù)機(jī)制,防止細(xì)胞在外界刺激下過度增殖甚至形成腫瘤。其中p53/p21通路是調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、導(dǎo)致細(xì)胞衰老、防止腫瘤發(fā)生的重要信號通路。本課題將用人脂肪干細(xì)胞及人真皮成纖維細(xì)胞進(jìn)行非接觸性間接共培養(yǎng),進(jìn)一步研究脂肪干細(xì)胞微環(huán)境對真皮成纖維細(xì)胞的作用,并通過測定成纖維細(xì)胞衰老相關(guān)性beta-半乳糖苷酶研究成纖維細(xì)胞衰老狀態(tài)的改變,另外還通過p53、p21蛋白的表達(dá),研究ASCs微環(huán)境對細(xì)胞復(fù)制及應(yīng)激衰老相關(guān)的p53/p21信號通路的變化。一、人脂肪干細(xì)胞分離、培養(yǎng)、鑒定及與成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)體系的建立目的:為研究人ASCs微環(huán)境與對真皮成纖維細(xì)胞的作用,需分離培養(yǎng)ASCs與成纖維細(xì)胞,并用Transwell小室構(gòu)建細(xì)胞間接共培養(yǎng)體系。方法:(1)各取5例青年人(年齡30歲)及老年人(年齡60歲)整塊腹部皮下脂肪組織(約5g)做CD44免疫組織化學(xué)染色,每張切片選擇4個(gè)視野做陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)并觀察CD44細(xì)胞分布。(2)用負(fù)壓針管抽吸或切除的脂肪組織分離培養(yǎng)ASCs,并用流式細(xì)胞儀對CD34、CD44、CD90做細(xì)胞鑒定。(3)分離培養(yǎng)人真皮成纖維細(xì)胞,并用Transwell小室與ASCs構(gòu)建間接細(xì)胞共培養(yǎng)體系。結(jié)果:(1)脂肪組織的免疫組化染色發(fā)現(xiàn)CD44+細(xì)胞主要位于纖維結(jié)締組織中,與血管內(nèi)皮細(xì)胞緊密聯(lián)系。(2)用脂肪組織培養(yǎng)的原代ASCs的表面抗原表達(dá)為CD34(-)、CD44(+)、CD90(+)。(3)用Transwell小室成功建立ASCs與成纖維細(xì)胞間接共培養(yǎng)體系。結(jié)論:CD44+細(xì)胞主要位于脂肪的纖維結(jié)締組織中,用注射器抽取的游離脂肪組織可以增加膠原酶消化效率,得到足夠的原代ASCs,其抗原表達(dá)為CD34(-)、CD44(+)、CD90(+)。用Transwell小室可以構(gòu)建ASCs與成纖維細(xì)胞間接共培養(yǎng)體系。二、脂肪干細(xì)胞微環(huán)境對真皮成纖維細(xì)胞功能的影響目的:研究脂肪干細(xì)胞旁分泌因子所構(gòu)成的微環(huán)境對不同年齡人成纖維細(xì)胞功能的影響。方法:本實(shí)驗(yàn)將成纖維細(xì)胞分成4個(gè)組,分別在培養(yǎng)后24h、48h、72h用細(xì)胞增殖比色法MTT(四唑鹽)法檢測各組成纖維細(xì)胞增殖情況;用實(shí)時(shí)定量(real-time)PCR檢測I型膠原,基質(zhì)金屬蛋白酶-1(MMP-1)m RNA在成纖維細(xì)胞中的表達(dá)。結(jié)果:共培養(yǎng)組的青年和老年HDFs的細(xì)胞增殖均顯著高于相應(yīng)對照組(P0.01)。共培養(yǎng)老年HDFs的MMP-1 m RNA表達(dá)與對照組比較在48h后均顯著降低(P0.01)。其中共培養(yǎng)組MMP-1表達(dá)在48h時(shí)顯著下降(P0.01),但在72h時(shí)下降趨勢停止(P0.05)。在對照組,MMP-1的表達(dá)隨著時(shí)間延長逐漸升高(P0.05)。在前48 h中,共培養(yǎng)的老年HDFs的I型膠原蛋白的表達(dá)呈現(xiàn)逐漸增加,然后在72h略微下降(P0.05)。共培養(yǎng)青年HDFs的I型膠原表達(dá)在也前48h顯著升高(P0.01),并在72h顯著下降(P0.05)。對照組成纖維細(xì)胞的I型膠原的表達(dá)在24h和48h無顯著差異(P0.05),而青年對照組I型膠原表達(dá)在72h出現(xiàn)下降(P0.05)。結(jié)論:本部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明脂肪干細(xì)胞微環(huán)境可促進(jìn)共培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞的增殖,同時(shí)減少M(fèi)MP-1的產(chǎn)生,并增加I型膠原的表達(dá)。結(jié)果表明脂肪干細(xì)胞微環(huán)境可促進(jìn)細(xì)胞增殖,改善細(xì)胞的功能。但這種促進(jìn)作用隨著共培養(yǎng)時(shí)間的進(jìn)一步延長逐漸減小,表明脂肪干細(xì)胞微環(huán)境可能無法長時(shí)間改善成纖維細(xì)胞的功能。三、人脂肪干細(xì)胞微環(huán)境對成纖維細(xì)胞衰老狀態(tài)的改變及對p53/p21通路的影響目的:探索ASCs微環(huán)境對成纖維細(xì)胞衰老狀態(tài)的作用及對p53/p21通路的影響方法:分別在培養(yǎng)后24h、48h、72h用real-time PCR法檢測各組成纖維細(xì)胞衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶m RNA的變化;用western blot法檢測各組成纖維細(xì)胞p53、p21蛋白的表達(dá)。結(jié)果:兩個(gè)對照組成纖維細(xì)胞在第一個(gè)24h時(shí)在SA-β-Gal的表達(dá)無顯著差異(P0.05),培養(yǎng)24小時(shí)后各組HDFs中SA-β-Gal的m RNA表達(dá)水平的逐漸增加(P0.05)。老年組HDFs的SA-β-Gal的在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)均表現(xiàn)出更高的表達(dá)水平(P0.01)。兩個(gè)共培養(yǎng)組中的SA-β-Gal的表達(dá)較對照組顯著增加更顯著(P0.05)。在各時(shí)間點(diǎn)ASCs共培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞的p53蛋白較對照組的表達(dá)均顯著升高(P0.05),p21蛋白表達(dá)的檢測結(jié)果表現(xiàn)出與p53蛋白類似的逐漸升高的趨勢(P0.05),但其升高的幅度要小于p53蛋白。并且在第24h時(shí),共培養(yǎng)組與對照組p21蛋白的表達(dá)無顯著差異(P0.05)。結(jié)論:與脂肪干細(xì)胞微環(huán)境下共培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞的衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶m RNA表達(dá)會(huì)升高,并且隨著共培養(yǎng)時(shí)間的延長這種作用更加明顯,同時(shí)p53與p21蛋白也隨著培養(yǎng)的時(shí)間延長而增加,其中p53蛋白升高得更早、更快,表明脂肪干細(xì)胞微環(huán)境通過p53/p21通路促進(jìn)了成纖維細(xì)胞的衰老。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R339.38

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本文編號：1317482