發(fā)布時間：2017-12-21 18:19

  本文關(guān)鍵詞：L-periaxin蛋白結(jié)構(gòu)與功能研究　出處：《山西大學》2016年博士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：軸周蛋白Periaxin是施旺氏細胞中特異表達的支架蛋白之一。在施旺氏細胞包裹軸突形成髓鞘過程中,Periaxin調(diào)節(jié)著髓鞘的延展與修復(fù)、影響軸突的直徑大小及細胞內(nèi)外信號傳遞。缺失或突變periaxin蛋白的編碼基因PRX,將破壞外周周神經(jīng)系統(tǒng)中神經(jīng)纖維的聚集,從而引發(fā)脫髓鞘型腓骨肌萎縮癥CMT 4F亞型的發(fā)生。Periaxin蛋白還可作為哺乳動物品狀體纖維細胞膜的骨架蛋白,在跨膜信號傳遞、營養(yǎng)物質(zhì)輸送等過程中發(fā)揮作用。PRX基因編碼兩種長短不同的periaxin蛋白：L-periaxin和S-periaxin。 L-periaxin包含4個結(jié)構(gòu)域：N端PDZ結(jié)構(gòu)域、核定位信·NLS結(jié)構(gòu)域、重復(fù)區(qū)域以及C端酸性區(qū)域；S-periaxin只包含PDZ結(jié)構(gòu)域。木研究主要利用重組蛋白的表達、細胞脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、熒光光譜、細胞定位、免疫共沉淀、雙分子熒光互補等多種蛋白相互作用研究手段,分析不同結(jié)構(gòu)域在L-periaxin蛋白發(fā)揮功能中的作用。具體研究結(jié)果如下：1、以PRX基因為模板,將L-periaxin全長及各結(jié)構(gòu)域,分別克隆到真核表達載體上,利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、細胞定位、Western blot等實驗手段,明確了L-periaxin蛋白在RSC96細胞中存在多樣性的細胞定位；其中L-periaxin的PDZ結(jié)構(gòu)域調(diào)節(jié)L-periaxin核輸出,NLS結(jié)構(gòu)域影響核輸入；結(jié)構(gòu)域突變體EGFP-L-periaxindelPDZ定位細胞核；而EGFP-L-periaxindelNLS定位于胞質(zhì)。細胞增殖實驗表明,過表達PRX基因(L-periaxin+/+)及pEGFP-L-periaxindelPDZ轉(zhuǎn)染細胞后,細胞增殖速率明顯高于對照組；而NLS結(jié)構(gòu)域缺失突變體pEGFP-L-periaxindelNLS轉(zhuǎn)染細胞導致細胞生長速率明顯低于對照組。進一步的研究發(fā)現(xiàn),L-periaxin的酸性結(jié)構(gòu)域同樣影響L-periaxin的定位,其影響機制與Akt激酶誘導的L-periaxin磷酸化存在相關(guān)性。經(jīng)Scansite預(yù)測,將L-periaxin的1439位Ser殘基分別突變?yōu)锳la(S/A)或Glu(S/D),定位結(jié)果顯示,L-periaxin-1439(S/A)顯示在細胞核中定位高于WT-L-periaxin。而L-periaxin-1439(S/D)在細胞膜定位高于野生型WT-L-periaxin。L-periaxin不同的細胞學定位與其特殊的結(jié)構(gòu)域分布相關(guān)。2、DRP2屬于抗肌萎縮類蛋白家族,含有954個氨基酸殘基,包括有N端2個類血影蛋白(spectrin like repeat)結(jié)構(gòu)域和HWW結(jié)構(gòu)域,以及C端ZZ-type鋅指結(jié)構(gòu)域和coiled-coil結(jié)構(gòu)域。DRP2是第一個被報道與L-periaxin存在互作的糖蛋白,但參與兩蛋白彼此互作的區(qū)域以及二者具體的互作機制并不清楚。本研究通過Co-IP實驗方法,首先明確L-periaxin蛋白NLS結(jié)構(gòu)域是與DRP2蛋白N端相互作用的關(guān)鍵區(qū)域。L-periaxin蛋白NLS結(jié)構(gòu)域包括有：NLS1(118-139 aa),NLS2(162-175 aa)以及NLS3(183-194 aa)3個亞結(jié)構(gòu)域。重組表達L-periaxin蛋白NLS, NLS1, NLS2以及NLS3結(jié)構(gòu)域,以及DRP2蛋白N端不同結(jié)構(gòu)域。GST pull down、雙分子熒光互補、熒光光譜以及共定位結(jié)果表明：NLS2和NLS3為L-periaxin蛋白與DRP2蛋白互作的關(guān)鍵區(qū)域,而DRP2蛋白N端180-384 aa,即spectrin like 2+WW區(qū)域與L-periaxin蛋白NLS2和NLS3互作最為明顯;進一步細胞定位結(jié)果表明,L-periaxin蛋白NLS1亞結(jié)構(gòu)域只參與L-periaxin蛋白的核輸入。L-periaxin與DRP2互作區(qū)域的精細定位,為進一在蛋白水平探討L-periaxin與脫髓鞘型腓骨肌萎縮癥4F亞型的發(fā)生機制提供參考。3、著絲粒相關(guān)蛋白Zwint-1是細胞有絲分裂過程中重要的檢查蛋白,同時Zwint-1與DRP2蛋白N端1-384區(qū)域也存在特異性的結(jié)合。為進一步明確L-periaxin、DRP2與Zwint-1三者之間關(guān)系,分別構(gòu)建了Zwint-1的真核及原核表達載體,Co-IP及pull down結(jié)果表明：DRP2血影蛋白結(jié)構(gòu)域,即N端1-349區(qū)域,是其與Zwint-1結(jié)合的關(guān)鍵區(qū)域；進一步分子互補實驗結(jié)果表明,L-periaxin-NLS蛋白的過表達,明顯消弱DRP2與Zwint-1蛋白的結(jié)合。L-periaxin與Zwint-1競爭性結(jié)合DRP2蛋白的作用模式,為深入研究L-periaxin與DRP2蛋白的互作機制,以及施旺氏細胞的成熟與發(fā)育等提供參考。4、CMT是一種常見的常染色體顯隱性遺傳病,目前共發(fā)現(xiàn)有10多個亞型,克隆到至少30個疾病基因。通過借助孟德爾遺傳疾病OMIN數(shù)據(jù)庫及文獻報道,共搜集到與CMT相關(guān)的71個候選基因,通過在線工具DAVID及GO富集,分析CMT相關(guān)突變基因中單核苷酸突變位點的分布與功能：進一步通路富集結(jié)果表明：氨酰t-RNA合成信號通路(hsa00970)與CMT類疾病的發(fā)生盟著相關(guān)。對于periaxin蛋白細胞定位、蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建、及CMT相關(guān)突變基因的代謝通路研究,將為施旺氏細胞的發(fā)育及再生、CMT 4F疾病的全面認識等提供重要的參考。
【學位授予單位】：山西大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：Q51

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本文編號：1316708