本文關(guān)鍵詞：Serpin-5對家蠶免疫系統(tǒng)的調(diào)控作用研究　出處：《西北農(nóng)林科技大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：昆蟲種類繁多、生長環(huán)境多樣,在生物鏈中扮演著重要角色。很多昆蟲的幼蟲生長于腐爛的有機(jī)質(zhì)中,或者成為傳播植物或動物病原的載體。昆蟲在長期的進(jìn)化過程中形成了一套有效的防御機(jī)制,即堅(jiān)硬的體壁及其完善的免疫系統(tǒng)。昆蟲的免疫系統(tǒng)主要由體液免疫和細(xì)胞免疫組成,體液免疫指在昆蟲血淋巴中對病原物的識別,蛋白酶的級聯(lián)反應(yīng),誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗菌肽(antimicrobial peptides,AMPs),黑化反應(yīng)(melanization)的中間產(chǎn)物,及其他存在于體液中的免疫因子等。昆蟲的細(xì)胞免疫指由血細(xì)胞介導(dǎo)的吞噬(phagocytosis)、結(jié)瘤(nodulation)、包囊(encapsulation)等作用。抗菌肽是體液免疫中對入侵的病原菌具有直接殺傷力的效應(yīng)因子,它在昆蟲免疫中具有舉足輕重的作用。黑化反應(yīng)主要作用于傷口愈合、包囊黑化,以及在血淋巴中對病原微生物的直接殺滅,它是昆蟲免疫中不可缺少的關(guān)鍵反應(yīng)。而酚氧化酶(Phenoloxidase,PO)是黑化反應(yīng)中的關(guān)鍵酶。產(chǎn)生抗菌肽的Toll途徑和酚氧化酶前體(proPhenoloxidase,PPO)都需要在識別病原微生物后激活胞外絲氨酸蛋白酶(Serine Protease)級聯(lián)反應(yīng)從而被激活。在昆蟲免疫中,Serpin(serine protease inhibitor)家族的蛋白參與負(fù)調(diào)控抗菌肽的產(chǎn)生以及酚氧化酶原的激活。家蠶(Bombyx mori)作為鱗翅目的模式昆蟲,對其Serpin的研究起于早期日本學(xué)者的探索,但后期并未有深入的研究。直到完成家蠶全基因組測序,家蠶Serpin的研究又開始受到關(guān)注,但仍然處于起步階段,家蠶多數(shù)Serpin的功能并未被深入探索。本研究主要對家蠶Serpin-5(BmSpn-5)蛋白進(jìn)行了原核表達(dá)、純化,詳細(xì)深入地研究了BmSpn-5對家蠶免疫系統(tǒng)的調(diào)控,并初步探索了其機(jī)制。研究結(jié)果如下:(1)本試驗(yàn)在家蠶體內(nèi)建立了包囊黑化的模型。為探明BmSpn-5是否對包囊黑化起作用,本試驗(yàn)首先在家蠶體內(nèi)建立了QFF瓊脂糖凝膠顆粒(Q-Sepharose Fast Flow)在家蠶血腔內(nèi)發(fā)生包囊黑化的模型。QFF凝膠顆粒能夠迅速地引起家蠶的包囊反應(yīng),1h時就能觀察到大量血細(xì)胞包圍在凝膠顆粒周圍。8h時,血細(xì)胞已基本完成包囊作用,形成了外圍和內(nèi)層血細(xì)胞致密、中間血細(xì)胞松散的三個層次的包囊結(jié)構(gòu)。并且包囊大多粘附在家蠶的組織上。部分QFF凝膠顆粒會發(fā)生包囊黑化作用,發(fā)生部位在凝膠顆粒表層而非其周圍的血細(xì)胞。黑化作用主要發(fā)生在前8小時內(nèi),在這段時間內(nèi)發(fā)生黑化的凝膠顆粒的比例迅速增長,其后便會進(jìn)入平臺期。(2)本研究對BmSpn-5進(jìn)行了基因序列分析、原核表達(dá)和重組蛋白的純化�；蛐蛄型葱苑治霰砻鰾mSpn-5與煙草天蛾(Manduca sexta)Serpin-5同源性最高,暗示二者具有相似的生物功能。Bm Spn-5蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測表明它是一個具有抑制活性的Serpin蛋白。我們利用pET32a質(zhì)粒及BL21(DE3)菌株,成功地在細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)出了BmSpn-5重組蛋白。隨后經(jīng)過鎳親和柱純化,腸激酶酶切,再次經(jīng)過鎳柱及陰離子交換柱(Q柱)的純化最終得到了純度較高BmSpn-5重組蛋白。此外,我們利用純化的重組蛋白制備了BmSpn-5的抗體,其效價較高。(3)本試驗(yàn)研究出BmSpn-5參與家蠶免疫應(yīng)答,并且負(fù)調(diào)控家蠶抗菌肽的誘導(dǎo)產(chǎn)生。在家蠶體內(nèi),細(xì)菌的入侵能夠引起脂肪體中BmSpn-5顯著的上調(diào)表達(dá),表明BmSpn-5參與免疫應(yīng)答。將重組Bm Spn-5蛋白注射到家蠶幼蟲體內(nèi),隨后感染細(xì)菌從而引起家蠶免疫反應(yīng)。24小時后,發(fā)現(xiàn)注射BmSpn-5重組蛋白的實(shí)驗(yàn)組其血漿抗菌活性較低;電泳圖中在抗菌肽Gloverin和Cecropin的位置,對照組和實(shí)驗(yàn)組的條帶差異明顯;定量PCR檢測到家蠶抗菌肽gloverin-3,cecropin-D,-E的表達(dá)受到Bm Spn-5蛋白的負(fù)調(diào)控。這些結(jié)果表明BmSpn-5對家蠶抗菌肽的產(chǎn)生具有負(fù)調(diào)控作用。(4)本試驗(yàn)檢測到BmSpn-5抑制家蠶PPO的激活,從而抑制黑化反應(yīng)。將重組BmSpn-5蛋白注射到家蠶幼蟲體內(nèi),隨后為其注射QFF凝膠顆粒,4小時之后候檢測包囊黑化作用,發(fā)現(xiàn)注射Bm Spn-5重組蛋白的實(shí)驗(yàn)組其包囊發(fā)生黑化的比例明顯低于對照組。給家蠶幼蟲注射滅活的耶爾森氏菌(Yersinia pseudotuberculosis serotype O:3,YPIII)會引起家蠶全局黑化反應(yīng),若提前為家蠶注射BmSpn-5重組蛋白則會避免全局黑化反應(yīng)的發(fā)生。PO是黑化反應(yīng)中的關(guān)鍵酶,實(shí)驗(yàn)表明BmSpn-5重組蛋白能夠抑制由E.coli-PG,LPS及Curdlan引起的PO的活性,并且能夠抑制PPO的剪切及PO與其它分子形成高分子復(fù)合物。這些結(jié)果表明BmSpn-5通過抑制家蠶PPO的剪切激活從而抑制黑化作用的發(fā)生。(5)最后,本試驗(yàn)分析鑒定了家蠶血淋巴中BmSpn-5的可能靶標(biāo)蛋白酶。根據(jù)Serpin蛋白和其底物能夠形成共價復(fù)合體的特點(diǎn),利用免疫共沉淀的方法,我們獲得了家蠶血淋巴中BmSpn-5與其底物蛋白酶形成的復(fù)合體。質(zhì)譜分析表明復(fù)合體含有絲氨酸蛋白酶BmHP6和BmSP21。表明BmSpn-5可能通過直接抑制絲氨酸蛋白酶BmHP6和/或BmSP21來負(fù)調(diào)控家蠶抗菌肽和PPO的激活。綜上,本研究闡明了Bm Spn-5在家蠶體內(nèi)參與免疫應(yīng)答,其對具體的免疫途徑如抗菌肽的誘導(dǎo)表達(dá)途徑和黑化反應(yīng)的激活途徑具有負(fù)調(diào)控的作用,該作用可能通過直接抑制家蠶血淋巴中BmHP6和/或BmSP21的活性而完成。
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：Q966

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