發(fā)布時間：2017-12-21 01:30

  本文關(guān)鍵詞：基于代謝工程選育谷氨酸棒桿菌L-蛋氨酸高產(chǎn)菌　出處：《哈爾濱工業(yè)大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：L-蛋氨酸是唯一一種含硫必需氨基酸,在生命體各種重要的代謝活動中起著不可替代的作用,被廣泛應(yīng)用于多個領(lǐng)域。作為一種飼料添加劑,其需求量巨大且附加值高,工業(yè)上蛋氨酸的生產(chǎn)方法仍是化學(xué)合成法或水解蛋白法。鑒于L-蛋氨酸至今未實現(xiàn)微生物發(fā)酵法工業(yè)生產(chǎn),且其代謝工程理論研究匱乏,本研究以谷氨酸棒桿菌ATCC13032為出發(fā)菌株,基于代謝工程原理,構(gòu)建了一株高產(chǎn)L-蛋氨酸的工程菌株,并分析不同遺傳操作對L-蛋氨酸產(chǎn)量的影響,進而尋找出L-蛋氨酸生物合成途徑中的關(guān)鍵靶點。其主要研究結(jié)果如下:為了獲得一株過產(chǎn)L-蛋氨酸的平臺菌株,本研究首先分析了不同L-蛋氨酸吸收系統(tǒng)缺失對L-蛋氨酸重吸收作用的影響。結(jié)果表明,Met D蛋白復(fù)合體是L-蛋氨酸的主要吸收系統(tǒng),并且谷氨酸棒桿菌△met D的L-蛋氨酸產(chǎn)量最高。在谷氨酸棒桿菌△met D的基礎(chǔ)上,通過誘變解除了來自末端代謝產(chǎn)物對L-蛋氨酸合成途徑的反饋抑制作用。獲得了一株具有L-蛋氨酸結(jié)構(gòu)類似物抗性的突變株谷氨酸棒桿菌5-16,其L-蛋氨酸產(chǎn)量為2.54 g/L,提升了約9倍,對底物得率為0.028 mol/mol。該菌株中L-蛋氨酸分支合成途徑的7個酶的轉(zhuǎn)錄水平均有顯著提高,且遺傳性能穩(wěn)定,是一株優(yōu)良的L-蛋氨酸生產(chǎn)平臺菌株。為了強化L-蛋氨酸合成途徑,本研究采用基因敲除和基因定點突變技術(shù),阻斷或弱化了L-蛋氨酸的競爭代謝徑,并解除了來自中間代謝產(chǎn)物的反饋抑制作用。敲除thr B基因阻斷了L-蘇氨酸合成,替換dap A基因的強起始密碼子為弱起始密碼子削弱了L-賴氨酸分支途徑,定點突變lys C基因和pyc基因解除天冬氨酸激酶和丙酮酸羧化酶的反饋抑制作用,最終獲得谷氨酸棒桿菌LY-4。結(jié)果表明,天冬氨酸激酶節(jié)點對L-蛋氨酸的生物合成有極顯著影響,L-蛋氨酸產(chǎn)量最終上升至5.89 g/L,對底物得率為0.072 mol/mol。在谷氨酸棒桿菌LY-4遺傳背景下,敲除mcb R基因不利于L-蛋氨酸生產(chǎn)。構(gòu)建了一個新型大腸桿菌-谷氨酸棒桿菌穿梭組成型表達載體p LY-4。其具有一個含11個酶切位點的多克隆位點MCS;具有氯霉素抗性和基于alr基因的無選擇標記兩套篩選系統(tǒng),氯霉素抗性標記適用于實驗室規(guī)模操作,alr基因作為篩選標記可滿足無抗生素條件下的發(fā)酵生產(chǎn);攜帶tac M強啟動子,并且去除了lac Iq基因?qū)幼拥恼T導(dǎo)表達,為組成型表達載體。通過對表達載體p LY-4性能的驗證,證明p LY-4是一個適用于谷氨酸棒桿菌工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)的新型載體。在谷氨酸棒桿菌LY-4的基礎(chǔ)上,比較不同遺傳操作增加胞內(nèi)NADPH供應(yīng)對L-蛋氨酸產(chǎn)量的影響,結(jié)果表明異源表達gap C基因能夠顯著提高L-蛋氨酸產(chǎn)量。最終利用新型表達載體p LY-4在谷氨酸棒桿菌LY-4中過表達外源基因gapC,獲得重組菌株命名為谷氨酸棒桿菌LY-6,發(fā)酵結(jié)果表明L-蛋氨酸產(chǎn)量上升至7.23 g/L,對底物得率為0.110 mol/mol。探索一些低價值原料作為碳源和氮源進行發(fā)酵生產(chǎn)L-蛋氨酸,降低生產(chǎn)成本。利用響應(yīng)面法優(yōu)化谷氨酸棒桿菌LY-6的發(fā)酵培養(yǎng)基成分和發(fā)酵工藝參數(shù),用上述優(yōu)化后培養(yǎng)基成分及工藝參數(shù)進行發(fā)酵,最終L-蛋氨酸產(chǎn)量達到9.88g/L,比優(yōu)化前提高了26.82%,對底物得率也提高到0.133 mol/mol。
【學(xué)位授予單位】：哈爾濱工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：Q93

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本文編號：1314189