發(fā)布時間：2017-12-20 20:41

  本文關(guān)鍵詞：AP-3調(diào)控擬南芥PAT10液泡運(yùn)輸途徑和花粉管生長　出處：《山東農(nóng)業(yè)大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：植物液泡作為植物中特有的細(xì)胞器,通過調(diào)控離子平衡、次生代謝物質(zhì)儲存維持滲透壓等參與植物響應(yīng)環(huán)境信號、生長發(fā)育等生命過程。定位在液泡膜上的離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、酶類等對于液泡發(fā)揮這些功能至關(guān)重要。這些蛋白質(zhì)經(jīng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)后通過多條途徑到達(dá)液泡。兩條經(jīng)典的運(yùn)輸途徑,經(jīng)COP(40)(40)復(fù)合體介導(dǎo)從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到達(dá)高爾基體后由小G蛋白Rab5或者Rab5和Rab7共同介導(dǎo)到達(dá)液泡;一條是由銜接蛋白復(fù)合體3(Adaptor Protein Complex-3,AP-3)參與的過程,但該過程的分子機(jī)理研究甚少,只有少數(shù)底物研究的報道;最新被發(fā)現(xiàn)的一條途徑是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)直接靶向液泡膜的途徑,該過程的分子機(jī)理也尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)棕櫚�；D(zhuǎn)移酶10(Protein S-Acyl Transferase 10,PAT10)靶向液泡膜不受Rab5-DN的阻斷,這就暗示PAT10通過非經(jīng)典的運(yùn)輸途徑靶向液泡膜。為了探究非經(jīng)典運(yùn)輸途徑的參與因子以及特異性識別序列,本研究利用PAT10-GFP的材料進(jìn)行了基于熒光的正向遺傳學(xué)篩選、遺傳干擾、結(jié)構(gòu)域解析及創(chuàng)制嵌合蛋白等實(shí)驗(yàn),主要結(jié)果和結(jié)論如下:(1)PAT10經(jīng)非經(jīng)典的運(yùn)輸途徑靶向液泡膜經(jīng)典的運(yùn)輸途徑可以被小G蛋白Rab5-DN(Dominant negative)形式阻斷,Rab5-DN形式可以競爭性的結(jié)合Qg源的GEF蛋白,從而導(dǎo)致對Qg源的Rab5蛋白功能的遺傳干擾。本研究首先利用細(xì)胞特異性啟動子驅(qū)動Rab5-DN的表達(dá)可以阻斷肌醇轉(zhuǎn)移載體INT1(Inositiol Transporter 1)靶向液泡膜的運(yùn)輸,INT1是已知的從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)經(jīng)高爾基的囊泡運(yùn)輸途徑到達(dá)液泡膜上的跨膜蛋白。證明這種遺傳干擾確實(shí)能夠阻斷經(jīng)高爾基體的液泡運(yùn)輸途徑。將Rab-5DN轉(zhuǎn)基因材料通過雜交引入PAT10-GFP植株中,通過熒光成像發(fā)現(xiàn)Rab5-DN的表達(dá)并沒有干擾PAT10在液泡膜上的定位。這暗示PAT10在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上合成后,不經(jīng)過TGN直接到達(dá)液泡膜,即PAT10經(jīng)非經(jīng)典的運(yùn)輸途徑靶向液泡膜。(2)PAT10的酶活區(qū)和C端對其亞細(xì)胞定位十分關(guān)鍵PAT10的蛋白結(jié)構(gòu)相對簡單,包括4個跨膜區(qū)、酶活區(qū)以及N-和C-端非催化區(qū)。本研究通過體外DNA操作,對PAT10的不同結(jié)構(gòu)域進(jìn)行缺失,并將GFP-融合的嵌合蛋白引入到pat10-1中。通過對pat10-1表型互補(bǔ)與否,亞細(xì)胞定位如何,以及對Rab5-DN及藥劑干擾的響應(yīng)等研究,我們發(fā)現(xiàn):N端缺失的嵌合蛋白可以互補(bǔ)突變體的表型,不影響PAT10定位到液泡膜上,但受Rab5-DN阻斷,說明N端影響PAT10的運(yùn)輸途徑;酶活區(qū)以及C端缺失的嵌合蛋白不能互補(bǔ)突變體的表型,定位發(fā)生改變,說明酶活區(qū)以及c端對于pat10的功能和定位十分關(guān)鍵。(3)pat10經(jīng)ap-3途徑靶向液泡為了探究pat10經(jīng)哪條運(yùn)輸途徑靶向液泡膜,以及該途徑都有哪些調(diào)控因子參與。本研究對pat10-gfp;pat10-1的材料進(jìn)行了ems誘變,又由于花粉是單倍體,經(jīng)誘變后m0代即可表現(xiàn)出表型,并且其孢子體有一個拷貝是野生型的,可以排除孢子體對花粉的影響,該方法可以顯著減少篩選的時間。本研究對pat10-gfp;pat10-1誘變的m0植株材料的花粉管進(jìn)行了pat10-gfp定位的篩選,并且獲得了兩個突變材料,分別命名為reva1-1和reva1-2。通過圖位克隆以及測序的方法,我們發(fā)現(xiàn)reva1編碼ap-3δ亞基。將pat10-gfp通過雜交的方法引入到ap-3δ亞基的t-dna插入突變體pat4-2中,發(fā)現(xiàn)同reva1-1和reva1-2中結(jié)果一致,pat10-gfp定位到高爾基上。等位檢測以及互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)都證明pat10經(jīng)ap-3介導(dǎo)從高爾基靶向液泡膜。(4)cop(40)(40)的小g蛋白sar1參與ap-3運(yùn)輸途徑cop(40)(40)介導(dǎo)囊泡從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基的運(yùn)輸過程。利用cop(40)(40)復(fù)合體的小g蛋白sar1-dn可以阻斷該運(yùn)輸途徑。首先利用細(xì)胞特異性啟動子驅(qū)動sar1c-dn的表達(dá)可以阻斷int1靶向液泡膜的運(yùn)輸,證明這種遺傳干擾確實(shí)能夠阻斷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基的囊泡運(yùn)輸途徑。蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白suc4和pat10-gfp在ap-3δ亞基的突變體中的信號滯留在高爾基上(wolfenstetteretal.,2012),這就暗示ap-3在高爾基上介導(dǎo)囊泡運(yùn)輸靶向液泡。為了探究是否由cop(40)(40)介導(dǎo)這些蛋白質(zhì)從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)靶向高爾基,本研究通過瞬時轉(zhuǎn)化體系以及雜交的手段將gfp-suc4和pat10-gfp引入到sar1c-dn的材料中,發(fā)現(xiàn)suc4和pat10在該遺傳干擾的材料中液泡膜的信號減弱,這表明ap-3運(yùn)輸?shù)牡鞍捉?jīng)cop(40)(40)途徑從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到達(dá)高爾基。(5)hops參與ap-3介導(dǎo)的囊泡與液泡的融合酵母中的研究表明hops復(fù)合體參與了囊泡的融合過程。為了探究ap-3介導(dǎo)的囊泡到達(dá)液泡附近后是否由hops介導(dǎo)與液泡融合。本研究利用hops復(fù)合體的vps41亞基的突變體進(jìn)行了研究。由于vps41-1的花粉管不能傳代,不能獲得vps41-1純和突變體,所以本研究利用花粉管作為系統(tǒng)進(jìn)行了pat10-gfp定位的分析。通過熒光成像發(fā)現(xiàn),在vps41-1花粉管中pat10的定位變成了點(diǎn)狀,為了排除該點(diǎn)狀的結(jié)構(gòu)不是變形的液泡,本研究利用化學(xué)染料Oregon Green對花粉管進(jìn)行了染色以及三維重構(gòu)了花粉管中液泡,結(jié)果表明vps41-1的花粉管中液泡形態(tài)確實(shí)出現(xiàn)異常,但與PAT10以及CBL2的定位并不一致,CBL2-RFP在野生型中是液泡膜的定位,在vps41-1花粉管中的定位變成了質(zhì)膜。說明HOPS參與了AP-3介導(dǎo)的囊泡與液泡融合過程。(6)AP-3介導(dǎo)的液泡融合過程調(diào)控花粉管的生長花粉管的生長對植物能夠成功完成有性生殖過程十分重要。液泡儲藏物質(zhì)以及蛋白的運(yùn)輸和液泡的動態(tài)組裝對花粉管生長十分關(guān)鍵,但起關(guān)鍵作用的因子并不清楚。本研究中報道了銜接蛋白復(fù)合體AP-3及兩個定位在液泡膜上的蛋白在花粉管生長過程中發(fā)揮重要功能。擬南芥中AP-3調(diào)控多種蛋白質(zhì)靶向液泡膜的運(yùn)輸,其中棕櫚�；D(zhuǎn)移酶10(PAT10)和SNARE蛋白VAMP711分別參與了鈣離子信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)過程和液泡膜的動態(tài)融合過程。復(fù)合體AP-3各亞基的缺失突變會影響雄配子傳代率,通過分析各亞基的突變體發(fā)現(xiàn),AP-3功能缺失影響了花粉管體外和體內(nèi)的生長過程,而不影響花粉的發(fā)育和導(dǎo)向性生長過程。PAT10和VAMP711功能缺失也影響了花粉的生長過程,暗示經(jīng)AP-3介導(dǎo)的PAT10和VAMP711到達(dá)液泡膜的過程對于花粉管生長至關(guān)重要。本研究中還展示了AP-3的功能缺失影響了液泡的動態(tài)組裝過程,野生型花粉管中液泡呈現(xiàn)為管狀結(jié)構(gòu),但突變體中管狀結(jié)構(gòu)的液泡顯著減少,并且在液泡的末端會形成球狀結(jié)構(gòu)。本研究證明了AP-3在生殖過程中發(fā)揮重要功能,為研究液泡參與調(diào)控細(xì)胞極性生長過程提供了新的線索。
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：Q945

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本文編號：1313366