流行性乙型腦炎病毒在宿主選擇壓力下基因變異規(guī)律的研究
發(fā)布時(shí)間：2017-12-18 17:22
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【摘要】：流行性乙型腦炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)屬于黃病毒科,是具有包膜的單股正鏈RNA病毒,基因組全長為10 976個(gè)核苷酸,由5’與3’非編碼區(qū)及中間的單一開放讀碼框(open reading frame,ORF)組成,ORF首先編碼包含3432個(gè)氨基酸的多聚蛋白前體,經(jīng)酶切后形成3種結(jié)構(gòu)蛋白(C、PrM、E)和7種非結(jié)構(gòu)蛋白(NSl、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5)。病毒復(fù)制只能在宿主細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行。因此病毒基因變異必然會(huì)受到宿主選擇壓力的影響。JEV作為一種RNA病毒,由于RNA多聚酶缺乏校正功能,基因組核苷酸容易發(fā)生變異。在動(dòng)物宿主與媒介昆蟲宿主交替?zhèn)鞑ミ^程中,或者在單一儲(chǔ)存宿主持續(xù)感染狀態(tài)下,JEV發(fā)生基因變異產(chǎn)生的變異毒株受宿主選擇壓力影響,其中生存適合度較高的毒株,在宿主體內(nèi)的感染增殖能力較強(qiáng),容易獲得生長優(yōu)勢并成為優(yōu)勢毒株。深入研究JEV在宿主選擇壓力下基因變異規(guī)律,能夠?yàn)镴EV分子流行病學(xué)調(diào)查提供理論依據(jù),為流行性乙型腦炎疫情監(jiān)測預(yù)警和應(yīng)急防控提供技術(shù)支撐,為流行性乙型腦炎疫苗改進(jìn)、免疫效果評估和特效藥物研發(fā)提供數(shù)據(jù)支撐和靶標(biāo)指引。本研究選取京衛(wèi)研-1毒株(A2株,Beijing-1株或BJ-1株)和SA14毒株為實(shí)驗(yàn)對象,以蚊蟲細(xì)胞(Aedes albopictus clone,C6/36)和地鼠腎細(xì)胞(Baby hamster kidney,BHK)交替?zhèn)鞔鳛榧?xì)胞交替?zhèn)鞔鷮?shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?以三帶喙庫蚊與昆明鼠交替?zhèn)鞔鳛閯?dòng)物宿主與媒介蚊蟲交替?zhèn)鞔鷮?shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?模擬自然界中JEV在媒介蚊蟲和動(dòng)物宿主間交替?zhèn)鞑ミ^程。并對交替?zhèn)鞔a(chǎn)生的部分毒株進(jìn)行序列測定與分析比對,藉此研究JEV在動(dòng)物宿主與媒介蚊蟲交替?zhèn)鞔x擇壓力下基因變異規(guī)律。同時(shí),本研究將BJ-1毒株和SA14毒株分別在BHK細(xì)胞及C6/36細(xì)胞連續(xù)傳代,模擬自然界中JEV在單一儲(chǔ)存宿主體內(nèi)持續(xù)感染過程,建立單一細(xì)胞連續(xù)傳代實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ�。并對連續(xù)傳代產(chǎn)生的部分毒株進(jìn)行序列測定與分析比對,藉此研究JEV在單一宿主動(dòng)物選擇壓力下基因變異規(guī)律。此外,利用生物信息學(xué)技術(shù),檢索Gen Bank中JEV序列及相關(guān)信息,與本研究測定的毒株序列分析比對,對本研究建立的動(dòng)物宿主與媒介蚊蟲交替?zhèn)鞔鷮?shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ�、�?xì)胞交替?zhèn)鞔鷮?shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ秃蛦我患?xì)胞連續(xù)傳代實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ瓦M(jìn)行對比分析和效果評估,探討JEV在自然界的分子流行病學(xué)特征和基因變異規(guī)律。研究結(jié)果如下:1.BJ-1傳代毒株、SA14傳代毒株接種C6/36細(xì)胞及BHK細(xì)胞后均在3天左右出現(xiàn)典型細(xì)胞病變(Cell pathological effects,CPE)。腦內(nèi)接種JEV后3~5d,昆明乳鼠均出現(xiàn)散窩、抽搐、弓背等癥狀。BJ-1傳代毒株與SA14傳代毒株接種乳鼠后發(fā)病時(shí)間不存在顯著差異(P0.05)。2.BJ-1各組傳代毒株空斑滴度均值都顯著低于親本株空斑滴度;SA14各組傳代毒株則區(qū)別很大:經(jīng)BHK細(xì)胞連續(xù)傳代獲得的傳代毒株空斑滴度均值與親本株空斑滴度無顯著差異;經(jīng)C6/36細(xì)胞連續(xù)傳代獲得的傳代毒株空斑滴度均值顯著低于親本株空斑滴度;經(jīng)C6/36和BHK細(xì)胞交替?zhèn)鞔约敖?jīng)三帶喙庫蚊和昆明鼠交替?zhèn)鞔@得的傳代毒株空斑滴度均值都顯著高于親本株空斑滴度。3.BJ-1各組傳代毒株間空斑滴度均值不存在顯著差異;SA14各組傳代毒株間空斑滴度均值存在顯著差異,空斑滴度由高到低依次為:經(jīng)細(xì)胞交替?zhèn)鞔@得的傳代毒株、經(jīng)動(dòng)物宿主與媒介蚊蟲交替?zhèn)鞔@得的傳代毒株、經(jīng)BHK細(xì)胞連續(xù)傳代獲得的傳代毒株和經(jīng)C6/36細(xì)胞連續(xù)傳代獲得的傳代毒株。4.BJ-1各組傳代毒株核苷酸變異位點(diǎn)數(shù)均超過100個(gè);SA14親本株經(jīng)BHK細(xì)胞連續(xù)傳代獲得的傳代毒株和經(jīng)動(dòng)物宿主與媒介蚊蟲交替?zhèn)鞔@得的傳代毒株,核苷酸變異位點(diǎn)數(shù)也都超過100個(gè),而經(jīng)細(xì)胞交替?zhèn)鞔@得的傳代毒株和經(jīng)C6/36細(xì)胞連續(xù)傳代獲得的傳代毒株變異位點(diǎn)數(shù)均少于40個(gè)。BJ-1傳代毒株堿基變異類型均以T→C最多,而SA14傳代毒株堿基變異類型均以C→T最多。5.BJ-1傳代毒株和SA14傳代毒株核苷酸變異位點(diǎn)中發(fā)生回復(fù)突變的比例較高(分別為94.7%和91.8%),其中BJ-1親本株經(jīng)C6/36細(xì)胞連續(xù)傳代獲得的傳代毒株和經(jīng)動(dòng)物宿主與媒介蚊蟲交替?zhèn)鞔@得的傳代毒株,以及SA14親本株經(jīng)BHK細(xì)胞連續(xù)傳代獲得的傳代毒株回復(fù)突變比例顯著高于其他各組傳代毒株。6.BJ-1傳代毒株和SA14傳代毒株總的氨基酸變異位點(diǎn)數(shù)均為32個(gè),發(fā)生回復(fù)突變的比例較高(分別為87.5%和59.4%);經(jīng)動(dòng)物宿主與媒介蚊蟲交替?zhèn)鞔@得的傳代毒株變異位點(diǎn)數(shù)均多于其他實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛡鞔@得的傳代毒株;E蛋白變異位點(diǎn)數(shù)均多于其他蛋白。BJ-1傳代毒株和SA14傳代毒株氨基酸序列中與毒力、抗原性密切相關(guān)的氨基酸位點(diǎn)比較穩(wěn)定。7.BJ-1親本株經(jīng)動(dòng)物宿主與媒介蚊蟲交替?zhèn)鞔@得的傳代毒株發(fā)生回復(fù)突變的氨基酸位點(diǎn)數(shù)多于其他實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛡鞔@得的傳代毒株;SA14親本株經(jīng)BHK細(xì)胞連續(xù)傳代獲得的傳代毒株發(fā)生回復(fù)突變的氨基酸位點(diǎn)數(shù)多于其他實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛡鞔@得的傳代毒株。8.BJ-1親本株經(jīng)三種實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛡鞔@得的傳代毒株總的同義突變率為85.6%,dN/dS=0.17;SA14親本株經(jīng)三種實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛡鞔@得的傳代毒株總的同義突變率為77.3%,dN/dS=0.29;BJ-1毒株承受的純化選擇壓力高于SA14毒株。9.11個(gè)BJ-1傳代毒株(BP28、CP24、BCP8、BCP12、BCP16、BCP20、BCP24、BCP28、M10R10、M12R12、M14R14)與BJ-1親本株相似性顯著減低,與SA14親本株相似性增強(qiáng);7個(gè)SA14傳代毒株(BP12、M4R4、M6R6、M8R8、M10R10、M12R12、M14R14)與SA14親本株相似性顯著減低,與BJ-1親本株相似性增強(qiáng)。研究結(jié)論如下:1.建立JEV細(xì)胞交替?zhèn)鞔鷮?shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?與動(dòng)物宿主與媒介蚊蟲交替?zhèn)鞔鷮?shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛯Ρ?發(fā)現(xiàn)BJ-1親本株經(jīng)上述兩種實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛡鞔@得的兩組傳代毒株間在核苷酸序列變異、氨基酸序列變異以及生存適合度變化方面情況比較接近,但SA14親本株經(jīng)上述兩種實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛡鞔@得的兩組傳代毒株間存在顯著差別,提示不宜于采用細(xì)胞交替?zhèn)鞔鷮?shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ痛鎰?dòng)物宿主與媒介蚊蟲交替?zhèn)鞔Ｐ瓦M(jìn)行JEV基因組分子進(jìn)化研究。2.BJ-1親本株、SA14親本株經(jīng)動(dòng)物宿主與媒介蚊蟲交替?zhèn)鞔徒?jīng)細(xì)胞交替?zhèn)鞔@得的傳代毒株生存適合度均高于單一細(xì)胞連續(xù)傳代獲得的傳代毒株,提示蟲媒病毒進(jìn)化“平衡假說”(trade-off hypothesis)不適用于JEV。考慮到JEV毒力顯著強(qiáng)于絕大多數(shù)其他蟲媒病毒,這一進(jìn)化特征有利于JEV在儲(chǔ)存宿主體內(nèi)持續(xù)感染。3.經(jīng)三種實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛡鞔@得的BJ-1傳代毒株、SA14傳代毒株在生存適合度方面存在較大差別。部分氨基酸位點(diǎn)變異與JEV生存適合度變化有關(guān)。例如,E蛋白E49K、NS5蛋白R29K突變與JEV生存適合度降低相關(guān),NS1蛋白E127D突變與JEV生存適合度升高相關(guān)。4.經(jīng)三種實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛡鞔@得的BJ-1傳代毒株、SA14傳代毒株核苷酸變異頻率較高,變異位點(diǎn)數(shù)較多,回復(fù)突變發(fā)生率較高。核苷酸變異均為單個(gè)堿基點(diǎn)突變,未發(fā)生插入與缺失,顛換多于轉(zhuǎn)換。JEV核苷酸序列中容易發(fā)生變異的核苷酸位點(diǎn)比較固定,同時(shí)堿基變異類型也比較固定。5.經(jīng)三種實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛡鞔@得的BJ-1傳代毒株、SA14傳代毒株氨基酸序列中與毒力、抗原性密切相關(guān)的氨基酸位點(diǎn)變異頻率較低。6.經(jīng)三種實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛡鞔@得的BJ-1傳代毒株、SA14傳代毒株dN/dS均低于0.6,提示JEV承受純化選擇壓力,進(jìn)化速率比較緩慢。
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R373
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1 陳伯權(quán);許兆祥;柳元元;范瑞蓮;;利用空斑技術(shù)進(jìn)行流行性乙型腦炎病毒滴定和中和試驗(yàn)的初步報(bào)告[J];微生物學(xué)報(bào);1963年01期
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1 侯文俊;流行性乙型腦炎病毒在宿主選擇壓力下基因變異規(guī)律的研究[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2017年
，本文編號：1305010
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