本文關鍵詞：蘋果HMGR基因家族啟動子的克隆及功能分析

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【摘要】：萜類化合物不僅對植物的生長發(fā)育具有重要作用,同時也具有重要的商業(yè)價值。近年來,萜類代謝工程已成為研究熱點。了解萜類合成途徑的代謝調(diào)控對于利用代謝工程及基因工程等獲得有用的萜類化合物具有重要意義。HMGR是萜類合成中的甲羥戊酸代謝途徑的第一個限速酶,它催化HMG-CoA形成MVA,是細胞質萜類代謝中的重要調(diào)控位點。植物中的HMGR常以小基因家族的方式存在。它在植物的生長發(fā)育中起重要作用,同時對植物適應各種生理和環(huán)境因子起作用。本研究首先鑒定了蘋果HMGR基因家族的MdHMGR1、MdHMGR2及MdHMGR3三個基因的組織表達模式及誘導表達模式。然后克隆并獲得了蘋果HMGR基因家族的啟動子序列,并通過HMGR啟動子驅動的GUS基因在轉基因擬南芥中的時空表達模式及誘導表達模式確定蘋果HMGR基因表達的組織特異性及誘導因素。進一步通過缺失分析鑒定HMGR啟動子不同區(qū)域的功能。本實驗通過研究蘋果HMGR啟動子的結構和功能,以在轉錄水平了解蘋果HMGR基因的分子調(diào)控機制,進一步為蘋果MVA代謝途徑的調(diào)控提供理論基礎。主要結果如下:(1)蘋果HMGR基因家族的MdHMGR1、MdHMGR2及MdHMGR3三個基因雖然在蘋果嫩葉、老葉、莖、根及果實中均有表達,但表達模式有很大不同。MdHMGR1基因在根及果實中表達量最高,并且在不同組織中的表達水平差距不大。MdHMGR2基因的表達水平在根中最高,其次為果實、莖、嫩葉、老葉,表達水平在老葉中最低,其表達具有組織特異性。MdHMGR3基因在果實及根中表達量最高,并且在不同組織中的表達水平差距不大。(2)蘋果HMGR基因家族的MdHMGR1、MdHMGR2及MdHMGR3三個基因在ABA、ETH、GA、IAA、MeJA及SA處理下的誘導表達模式也有很大不同。在處理2h或4h時,MdHMGR1基因在這些激素的誘導處理下表達雖有所提高,但不顯著。MdHMGR2基因在這些激素的誘導處理下表達均有所提高,其中MdHMGR2基因在ETH、IAA、MeJA及SA處理4h下均有顯著提高,而MdHMGR2基因在ABA及GA處理4h時表達水平雖有所升高,但不顯著。在處理2h或4h時,MdHMGR3基因在這些激素除了ABA之外的誘導處理下表達雖有所提高,但不顯著。(3)將從NCBI上獲得的蘋果HMGR2mRNA序列(GenBank:EF580921.1)與蘋果基因組數(shù)據(jù)庫中的序列MDC015298.78(http://www.rosaceae.org/)進行比對,獲得hmgr2基因編碼序列上游2000bp序列,根據(jù)該序列設計引物phmgr2f和phmgr2r,從青香蕉蘋果基因組dna中擴增得到包含啟動子在內(nèi)的1509bp序列。(4)根據(jù)蘋果hmgr2mrna序列(genbank:ef580921.1)設計特異性引物hmgr2gsp和hmgr2ngsp,并進行5′smart-racepcr擴增,將第二輪pcr產(chǎn)物與pmd-18t載體連接并轉化大腸桿菌,利用pcr鑒定陽性轉化子并挑選15個陽性克隆進行搖菌并測序。結果表明,mdhmgr2基因的轉錄起始位點位于起始密碼子上游156bp處的a堿基。(5)通過plantcare及place數(shù)據(jù)庫對mdhmgr2啟動子序列進行預測分析,結果在-35至-29處有一個tata-box,其序列為tataaaa,這與tata-box通常位于轉錄起始位點上游32±7堿基的規(guī)律一致,表明其為典型的啟動子。同時發(fā)現(xiàn)mdhmgr2啟動子還含有許多響應激素的順式作用元件及與組織特異性表達有關的元件。(6)獲得mdhmgr2啟動子全長及其5′-缺失序列片段,共6個,與植物表達載體pbi121-gus進行重組,替代其上的camv35s啟動子,獲得一系列重組表達載體,分別命名為mdhmgr2p-d1、mdhmgr2p-d2、mdhmgr2p-d3、mdhmgr2p-d4、mdhmgr2p-d5及mdhmgr2p-d6。將該系列載體進行酶切鑒定及測序鑒定,發(fā)現(xiàn)構建成功。將構建好的啟動子系列載體轉化gv3101,并用花序浸染法轉化擬南芥,并將獲得的t3代轉基因擬南芥純化株系用于下一步的研究。(7)通過gus組織化學染色法研究mdhmgr2全長啟動子在轉基因擬南芥中的表達模式。結果發(fā)現(xiàn),在含有mdhmgr2p-d1片段的轉基因擬南芥中,gus在幼苗期3d、5d、10d及15d的根、下胚軸及子葉中均有表達,且表達量較高。而在30d的轉基因擬南芥中,gus只在根及剛長出的幼葉中有少量表達。在50d的轉基因擬南芥中,在完全伸展開的成熟葉片中無gus表達,而在剛長出的幼葉中有少量表達。在花發(fā)育時期,gus在花藥及柱頭中表達量較高。而在花瓣、雌蕊、果莢及種子中均不表達。進一步觀察發(fā)現(xiàn),gus在花藥中的花粉粒及花藥壁中均有表達。(8)在含有mdhmgr2p-d2片段的轉基因擬南芥中,gus表達模式與在含有mdhmgr2p-d1片段的轉基因擬南芥中的表達模式相似,只是在表達量上有所降低。在含有mdhmgr2p-d3片段的轉基因擬南芥中,gus在幼苗期3d、5d、10d及15d的根尖及子葉中均有表達,且表達量較低,而在下胚軸中不表達。而在30d的擬南芥苗中只在剛長出的幼葉中有少量表達。在50d的轉基因擬南芥中,在完全伸展開的成熟葉片中無gus表達,而在剛長出的幼葉中有少量表達。在花發(fā)育時期,gus活性只在花藥及柱頭中有表達。而在花瓣、雌蕊、果莢及種子中均不表達。進一步觀察發(fā)現(xiàn),GUS在花藥中的花粉粒及花藥壁中均有表達。對含有MdHMGR2P-D1、MdHMGR2P-D2及MdHMGR2P-D3的擬南芥10d幼苗中的GUS酶活進行熒光定量分析,結果發(fā)現(xiàn)GUS表達活性在含有MdHMGR2P-D1的擬南芥植株中最高。而在含有MdHMGR2P-D2及MdHMGR2P-D3的擬南芥植株中GUS表達活性分別只達到了含有MdHMGR2P-D1擬南芥植株的GUS活性的67%和21%。結果表明,MdHMGR2啟動子片段-1050至-827的缺失導致了GUS活性的大幅下降。在含有MdHMGR2P-D4、MdHMGR2P-D5及MdHMGR2P-D6的轉基因擬南芥植株中,GUS活性在任何組織及任意時期中均未檢測到。以上結果表明,MdHMGR2啟動子-1050至-827區(qū)域對于該啟動子維持高水平的活性具有重要作用。(9)通過GUS組織化學染色法發(fā)現(xiàn),在含有MdHMGR2P-D1的轉基因擬南芥植株中GUS活性也受ETH、IAA、MeJA及SA誘導表達。含有MdHMGR2P-D4、MdHMGR2P-D5及MdHMGR2P-D6的轉基因擬南芥植株在這些激素處理下仍然檢測不到GUS表達。通過GUS酶活熒光定量分析發(fā)現(xiàn),在ETH處理下,在含有MdHMGR2P-D1轉基因擬南芥中,GUS活性升高。而在含有MdHMGR2P-D2及MdHMGR2P-D3的擬南芥植株中,GUS活性未受誘導。在含有MdHMGR2P-D1、MdHMGR2P-D2及MdHMGR2P-D3的轉基因擬南芥中,GUS活性表達水平均受IAA、MeJA及SA誘導。通過EMSA分析發(fā)現(xiàn),有特異性的蛋白質與MdHMGR2啟動子-1050至-1005區(qū)域的ERE元件結合。結果表明,MdHMGR2啟動子-1050至-1005區(qū)域對于該啟動子應答乙烯具有重要作用。(10)擴增得到了一個與MdHMGR3基因同源性高達97.04%的Md HMGR3-like基因。表達模式分析發(fā)現(xiàn),Md HMGR3-like基因在根中表達水平遠高于其它組織并且受ETH、MeJA及SA顯著誘導。進一步擴增得到了MdHMGR3及MdHMGR3-like啟動子,二者序列比對發(fā)現(xiàn),其同源性為49.21%。將MdHMGR3及MdHMGR3-like啟動子分別轉入擬南芥中,結果顯示,MdHMGR3啟動子驅動GUS基因在擬南芥中以高水平呈組成型表達,而MdHMGR3-like啟動子驅動GUS基因在擬南芥中表現(xiàn)為根組織特異性表達。
【學位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：Q943.2

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1 況守龍;胡廷章;;啟動子的克隆和研究方法[J];重慶工學院學報(自然科學版);2007年01期

2 李志新;曹雙河;張相岐;張懷剛;;偽鵝觀草高分子量麥谷蛋白基因啟動子的克隆[J];長江大學學報(自科版)農(nóng)學卷;2007年02期

3 高剛;魯艷芹;韓金祥;趙麗;;雙啟動子對增強型綠色熒光蛋白表達的影響[J];中國生物制品學雜志;2009年10期

4 郝迪，

本文編號：1304101