發(fā)布時(shí)間：2017-12-18 12:09

  本文關(guān)鍵詞：蘋果HMGR基因家族啟動(dòng)子的克隆及功能分析

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【摘要】：萜類化合物不僅對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育具有重要作用,同時(shí)也具有重要的商業(yè)價(jià)值。近年來(lái),萜類代謝工程已成為研究熱點(diǎn)。了解萜類合成途徑的代謝調(diào)控對(duì)于利用代謝工程及基因工程等獲得有用的萜類化合物具有重要意義。HMGR是萜類合成中的甲羥戊酸代謝途徑的第一個(gè)限速酶,它催化HMG-CoA形成MVA,是細(xì)胞質(zhì)萜類代謝中的重要調(diào)控位點(diǎn)。植物中的HMGR常以小基因家族的方式存在。它在植物的生長(zhǎng)發(fā)育中起重要作用,同時(shí)對(duì)植物適應(yīng)各種生理和環(huán)境因子起作用。本研究首先鑒定了蘋果HMGR基因家族的MdHMGR1、MdHMGR2及MdHMGR3三個(gè)基因的組織表達(dá)模式及誘導(dǎo)表達(dá)模式。然后克隆并獲得了蘋果HMGR基因家族的啟動(dòng)子序列,并通過(guò)HMGR啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GUS基因在轉(zhuǎn)基因擬南芥中的時(shí)空表達(dá)模式及誘導(dǎo)表達(dá)模式確定蘋果HMGR基因表達(dá)的組織特異性及誘導(dǎo)因素。進(jìn)一步通過(guò)缺失分析鑒定HMGR啟動(dòng)子不同區(qū)域的功能。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究蘋果HMGR啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)和功能,以在轉(zhuǎn)錄水平了解蘋果HMGR基因的分子調(diào)控機(jī)制,進(jìn)一步為蘋果MVA代謝途徑的調(diào)控提供理論基礎(chǔ)。主要結(jié)果如下:(1)蘋果HMGR基因家族的MdHMGR1、MdHMGR2及MdHMGR3三個(gè)基因雖然在蘋果嫩葉、老葉、莖、根及果實(shí)中均有表達(dá),但表達(dá)模式有很大不同。MdHMGR1基因在根及果實(shí)中表達(dá)量最高,并且在不同組織中的表達(dá)水平差距不大。MdHMGR2基因的表達(dá)水平在根中最高,其次為果實(shí)、莖、嫩葉、老葉,表達(dá)水平在老葉中最低,其表達(dá)具有組織特異性。MdHMGR3基因在果實(shí)及根中表達(dá)量最高,并且在不同組織中的表達(dá)水平差距不大。(2)蘋果HMGR基因家族的MdHMGR1、MdHMGR2及MdHMGR3三個(gè)基因在ABA、ETH、GA、IAA、MeJA及SA處理下的誘導(dǎo)表達(dá)模式也有很大不同。在處理2h或4h時(shí),MdHMGR1基因在這些激素的誘導(dǎo)處理下表達(dá)雖有所提高,但不顯著。MdHMGR2基因在這些激素的誘導(dǎo)處理下表達(dá)均有所提高,其中MdHMGR2基因在ETH、IAA、MeJA及SA處理4h下均有顯著提高,而MdHMGR2基因在ABA及GA處理4h時(shí)表達(dá)水平雖有所升高,但不顯著。在處理2h或4h時(shí),MdHMGR3基因在這些激素除了ABA之外的誘導(dǎo)處理下表達(dá)雖有所提高,但不顯著。(3)將從NCBI上獲得的蘋果HMGR2mRNA序列(GenBank:EF580921.1)與蘋果基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列MDC015298.78(http://www.rosaceae.org/)進(jìn)行比對(duì),獲得hmgr2基因編碼序列上游2000bp序列,根據(jù)該序列設(shè)計(jì)引物phmgr2f和phmgr2r,從青香蕉蘋果基因組dna中擴(kuò)增得到包含啟動(dòng)子在內(nèi)的1509bp序列。(4)根據(jù)蘋果hmgr2mrna序列(genbank:ef580921.1)設(shè)計(jì)特異性引物hmgr2gsp和hmgr2ngsp,并進(jìn)行5′smart-racepcr擴(kuò)增,將第二輪pcr產(chǎn)物與pmd-18t載體連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌,利用pcr鑒定陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子并挑選15個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行搖菌并測(cè)序。結(jié)果表明,mdhmgr2基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)位于起始密碼子上游156bp處的a堿基。(5)通過(guò)plantcare及place數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)mdhmgr2啟動(dòng)子序列進(jìn)行預(yù)測(cè)分析,結(jié)果在-35至-29處有一個(gè)tata-box,其序列為tataaaa,這與tata-box通常位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游32±7堿基的規(guī)律一致,表明其為典型的啟動(dòng)子。同時(shí)發(fā)現(xiàn)mdhmgr2啟動(dòng)子還含有許多響應(yīng)激素的順式作用元件及與組織特異性表達(dá)有關(guān)的元件。(6)獲得mdhmgr2啟動(dòng)子全長(zhǎng)及其5′-缺失序列片段,共6個(gè),與植物表達(dá)載體pbi121-gus進(jìn)行重組,替代其上的camv35s啟動(dòng)子,獲得一系列重組表達(dá)載體,分別命名為mdhmgr2p-d1、mdhmgr2p-d2、mdhmgr2p-d3、mdhmgr2p-d4、mdhmgr2p-d5及mdhmgr2p-d6。將該系列載體進(jìn)行酶切鑒定及測(cè)序鑒定,發(fā)現(xiàn)構(gòu)建成功。將構(gòu)建好的啟動(dòng)子系列載體轉(zhuǎn)化gv3101,并用花序浸染法轉(zhuǎn)化擬南芥,并將獲得的t3代轉(zhuǎn)基因擬南芥純化株系用于下一步的研究。(7)通過(guò)gus組織化學(xué)染色法研究mdhmgr2全長(zhǎng)啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)基因擬南芥中的表達(dá)模式。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在含有mdhmgr2p-d1片段的轉(zhuǎn)基因擬南芥中,gus在幼苗期3d、5d、10d及15d的根、下胚軸及子葉中均有表達(dá),且表達(dá)量較高。而在30d的轉(zhuǎn)基因擬南芥中,gus只在根及剛長(zhǎng)出的幼葉中有少量表達(dá)。在50d的轉(zhuǎn)基因擬南芥中,在完全伸展開(kāi)的成熟葉片中無(wú)gus表達(dá),而在剛長(zhǎng)出的幼葉中有少量表達(dá)。在花發(fā)育時(shí)期,gus在花藥及柱頭中表達(dá)量較高。而在花瓣、雌蕊、果莢及種子中均不表達(dá)。進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn),gus在花藥中的花粉粒及花藥壁中均有表達(dá)。(8)在含有mdhmgr2p-d2片段的轉(zhuǎn)基因擬南芥中,gus表達(dá)模式與在含有mdhmgr2p-d1片段的轉(zhuǎn)基因擬南芥中的表達(dá)模式相似,只是在表達(dá)量上有所降低。在含有mdhmgr2p-d3片段的轉(zhuǎn)基因擬南芥中,gus在幼苗期3d、5d、10d及15d的根尖及子葉中均有表達(dá),且表達(dá)量較低,而在下胚軸中不表達(dá)。而在30d的擬南芥苗中只在剛長(zhǎng)出的幼葉中有少量表達(dá)。在50d的轉(zhuǎn)基因擬南芥中,在完全伸展開(kāi)的成熟葉片中無(wú)gus表達(dá),而在剛長(zhǎng)出的幼葉中有少量表達(dá)。在花發(fā)育時(shí)期,gus活性只在花藥及柱頭中有表達(dá)。而在花瓣、雌蕊、果莢及種子中均不表達(dá)。進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn),GUS在花藥中的花粉粒及花藥壁中均有表達(dá)。對(duì)含有MdHMGR2P-D1、MdHMGR2P-D2及MdHMGR2P-D3的擬南芥10d幼苗中的GUS酶活進(jìn)行熒光定量分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)GUS表達(dá)活性在含有MdHMGR2P-D1的擬南芥植株中最高。而在含有MdHMGR2P-D2及MdHMGR2P-D3的擬南芥植株中GUS表達(dá)活性分別只達(dá)到了含有MdHMGR2P-D1擬南芥植株的GUS活性的67%和21%。結(jié)果表明,MdHMGR2啟動(dòng)子片段-1050至-827的缺失導(dǎo)致了GUS活性的大幅下降。在含有MdHMGR2P-D4、MdHMGR2P-D5及MdHMGR2P-D6的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株中,GUS活性在任何組織及任意時(shí)期中均未檢測(cè)到。以上結(jié)果表明,MdHMGR2啟動(dòng)子-1050至-827區(qū)域?qū)τ谠搯?dòng)子維持高水平的活性具有重要作用。(9)通過(guò)GUS組織化學(xué)染色法發(fā)現(xiàn),在含有MdHMGR2P-D1的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株中GUS活性也受ETH、IAA、MeJA及SA誘導(dǎo)表達(dá)。含有MdHMGR2P-D4、MdHMGR2P-D5及MdHMGR2P-D6的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株在這些激素處理下仍然檢測(cè)不到GUS表達(dá)。通過(guò)GUS酶活熒光定量分析發(fā)現(xiàn),在ETH處理下,在含有MdHMGR2P-D1轉(zhuǎn)基因擬南芥中,GUS活性升高。而在含有MdHMGR2P-D2及MdHMGR2P-D3的擬南芥植株中,GUS活性未受誘導(dǎo)。在含有MdHMGR2P-D1、MdHMGR2P-D2及MdHMGR2P-D3的轉(zhuǎn)基因擬南芥中,GUS活性表達(dá)水平均受IAA、MeJA及SA誘導(dǎo)。通過(guò)EMSA分析發(fā)現(xiàn),有特異性的蛋白質(zhì)與MdHMGR2啟動(dòng)子-1050至-1005區(qū)域的ERE元件結(jié)合。結(jié)果表明,MdHMGR2啟動(dòng)子-1050至-1005區(qū)域?qū)τ谠搯?dòng)子應(yīng)答乙烯具有重要作用。(10)擴(kuò)增得到了一個(gè)與MdHMGR3基因同源性高達(dá)97.04%的Md HMGR3-like基因。表達(dá)模式分析發(fā)現(xiàn),Md HMGR3-like基因在根中表達(dá)水平遠(yuǎn)高于其它組織并且受ETH、MeJA及SA顯著誘導(dǎo)。進(jìn)一步擴(kuò)增得到了MdHMGR3及MdHMGR3-like啟動(dòng)子,二者序列比對(duì)發(fā)現(xiàn),其同源性為49.21%。將MdHMGR3及MdHMGR3-like啟動(dòng)子分別轉(zhuǎn)入擬南芥中,結(jié)果顯示,MdHMGR3啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GUS基因在擬南芥中以高水平呈組成型表達(dá),而MdHMGR3-like啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GUS基因在擬南芥中表現(xiàn)為根組織特異性表達(dá)。
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：Q943.2

【相似文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 況守龍;胡廷章;;啟動(dòng)子的克隆和研究方法[J];重慶工學(xué)院學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2007年01期

2 李志新;曹雙河;張相岐;張懷剛;;偽鵝觀草高分子量麥谷蛋白基因啟動(dòng)子的克隆[J];長(zhǎng)江大學(xué)學(xué)報(bào)(自科版)農(nóng)學(xué)卷;2007年02期

3 高剛;魯艷芹;韓金祥;趙麗;;雙啟動(dòng)子對(duì)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白表達(dá)的影響[J];中國(guó)生物制品學(xué)雜志;2009年10期

4 郝迪，

本文編號(hào)：1304101