本文關鍵詞：雨生紅球藻異養(yǎng)細胞光誘導積累蝦青素工藝的優(yōu)化與放大

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【摘要】：天然蝦青素是一種超強的抗氧化劑,具有巨大的經(jīng)濟價值和廣闊的市場前景,而雨生紅球藻(Haematococcus pluvialis)細胞被稱為天然蝦青素的“濃縮品”,因此培養(yǎng)雨生紅球藻積累天然蝦青素是當今微藻生物技術領域的研究熱點。傳統(tǒng)培養(yǎng)工藝通常分為兩階段：(1)綠色細胞的光自養(yǎng)培養(yǎng)；(2)綠色細胞在高光照、缺氮等脅迫條件下積累蝦青素的光誘導。綠色細胞的光自養(yǎng)通常在逐級(一般為3級)放大的光生物反應器中進行,培養(yǎng)過程易污染且營養(yǎng)與光強協(xié)同控制難度大；第二階段脅迫條件下蝦青素合成的機理尚未明晰,蝦青素積累效率較低,光誘導條件優(yōu)化與反應器放大等研究也亟待進一步開展。為解決上述問題并對相關機理進行深入探討,本文首先用異養(yǎng)代替?zhèn)鹘y(tǒng)的第一階段光自養(yǎng)從而獲得大量細胞,并觀測異養(yǎng)過程中藻細胞狀態(tài)的顯著變化。然后摸索不同狀態(tài)的異養(yǎng)細胞進行光誘導產(chǎn)蝦青素的可行性,同時開展異養(yǎng)轉光誘導的機理研究,提出光適應的策略；最后,對雨生紅球藻異養(yǎng)細胞光誘導產(chǎn)蝦青素的工藝進行放大研究,以期充分發(fā)揮異養(yǎng)效率高的技術優(yōu)勢并突破雨生紅球藻傳統(tǒng)的光自養(yǎng)產(chǎn)蝦青素的技術瓶頸。主要內(nèi)容和結論如下：(1)雨生紅球藻異養(yǎng)過程及放大研究：本文首先在搖瓶上比較了雨生紅球藻異養(yǎng)、自養(yǎng)及混養(yǎng)在細胞生長方面之差異,混養(yǎng)細胞增長速率最快,最后所達到的細胞數(shù)目也較高,達到55.5±2.97×104 mL-1,而異養(yǎng)及自養(yǎng)所能達到的細胞數(shù)目則分別為36.4±1.9×104 mL-1和9±0.55×104mL-1。隨后的補料分批培養(yǎng)過程表明,利用碳源抑制效應可以獲得不同狀態(tài)的細胞,主要表現(xiàn)為單細胞重量差別較大(介于0.2～3.5 ng cell-1)；異養(yǎng)過程中,胞內(nèi)的生化組成發(fā)生顯著變化,主要為蛋白含量持續(xù)下降,從初始的約45.67±2.65%降為異養(yǎng)結束時的14.16±0.51%,而碳水化合物及油脂的含量則從初始的12.45±0.72%及17.35±1.00%分別提高到45.444±1.64%和30.50±±1.10%；細胞形態(tài)也發(fā)生著顯著變化,由綠色游動細胞逐步轉變?yōu)椴粍幽z殼細胞及厚壁孢子態(tài)細胞。(2)光誘導條件的研究：異養(yǎng)結束時胞內(nèi)蝦青素含量很低,僅為0.1-0.5%,因此需要進行光誘導以促使蝦青素的累積。搖瓶誘導的結果表明,初始的最佳碳、氮源為醋酸鈉及硝酸鹽,含量分別為20 mM及2 mM；誘導的pH控制在7-8,適合的pH緩沖體系為40 mM HEPES(4-羥乙基哌嗪乙磺酸)；適合的誘導光強為400 μmol photons m-2s-1；紅光促進細胞的生長,而藍光則有利于胞內(nèi)蝦青素的積累,白光是最簡單和有效的光源；同等強度的人工光與自然光的誘導結果接近；連續(xù)光照條件下的細胞干重及胞內(nèi)蝦青素含量分別為1.9±0.05 g L-1和3.81±0.05%,12 h：12 h光暗循環(huán)條件下相應的值為1.54±0.03 g L-1和2.48±0.08%,分別比前者低了18.9%及34.9%；初始細胞密度與光照強度協(xié)同影響光誘導的結果,單細胞受光強度決定了最終的蝦青素產(chǎn)量；在0.1～0.6 vvm的通氣量范圍內(nèi),誘導過程pH及誘導結果均接近,為使得藻液充分混合,0.2 vvm的通氣量較為合適。(3)轉光誘導前對異養(yǎng)細胞進行光適應可以實現(xiàn)穩(wěn)定高效的誘導：不同狀態(tài)異養(yǎng)細胞光誘導后的結果相差較大,越接近厚壁孢子態(tài)的細胞的誘導效果越差。針對這種差異性和不穩(wěn)定性,開展了對異養(yǎng)細胞光適應的研究,結果表明：不經(jīng)過適應直接轉入強光400 μmol photons m-2 s-1誘導,則光漂白的細胞數(shù)目約占25%；適應階段適宜的中低光強為100μmol photons m-2 s-1,通過光適應能夠顯著減小由異養(yǎng)轉入光誘導時細胞的死亡率,表征光合性能的Fv/Fm值則由異養(yǎng)結束時的0.6升高到0.8,表明通過1天的光適應,胞內(nèi)的光合系統(tǒng)得到恢復。異養(yǎng)藻細胞轉入光誘導時其光合系統(tǒng)進行了自我修復,光合作用相關的D1蛋白等得以再生,其含量先逐步升高再降低；光合作用相關蛋白PsbO、PetC等的活性則逐步下降,表明在逆境的條件下,雨生紅球藻細胞具有自我防御能力,其通過促進胞內(nèi)蝦青素的合成以抵御外界的脅迫條件；光適應很好地解決了不同狀態(tài)異養(yǎng)細胞誘導結果不穩(wěn)定的問題。采用光適應策略對異養(yǎng)得到的三種狀態(tài)細胞即綠色游動細胞、不動膠殼細胞及厚壁孢子細胞進行了誘導結果的對比研究。(4)不同類型的反應器中光誘導工藝的放大和優(yōu)化：2,000 L跑道池的誘導效果較好,其細胞干重產(chǎn)率比200 L跑道池和10,000 L跑道池分別高近32.6%與41%；細胞在300 L平板式反應器中誘導約11天后的細胞干重與蝦青素含量比15 L平板式反應器低了24.5%及16.82%,顯示出平板反應器存在放大效應,但可以通過加內(nèi)部光源和全天候人工光照來解決,使得誘導效果與對照相當；柱式反應器放大后仍然較適合用于光誘導,70L柱式的誘導效果僅比1L柱式低了3.9%。(5)誘導工藝在多地戶外條件下的驗證及蝦青素產(chǎn)量與誘導光照總量、誘導平均溫度等理化因素之間模型的建立：對雨生紅球藻異養(yǎng)細胞光誘導高產(chǎn)蝦青素這一新模式的可行性,在不同氣候的多地戶外條件下進行了驗證；同時光照總量、平均溫度與蝦青素產(chǎn)量之間的關系研究表明：在整個誘導階段,蝦青素的體積產(chǎn)量與日光照總量之間符合Logistics關系；同時誘導的理論產(chǎn)量與誘導過程的平均溫度之間符合Gauss關系,其在平均溫度為22.7℃時候達到最大值,為準確預測誘導誘導結果提供參考。綜上所述,對異養(yǎng)的條件優(yōu)化實現(xiàn)了雨生紅球藻的高效培養(yǎng),比較分析了異養(yǎng)細胞生化組成及光合系統(tǒng)差異后,優(yōu)化了異養(yǎng)轉光誘導的培養(yǎng)條件并針對性地提出了光適應的策略,實現(xiàn)了異養(yǎng)的高效率與異養(yǎng)細胞光誘導產(chǎn)蝦青素的高效率兩者的統(tǒng)一；異養(yǎng)細胞經(jīng)過光誘導產(chǎn)蝦青素的可行性在多地不同氣候條件下得到了驗證,光誘導過程蝦青素積累與光照、溫度之間的模型隨之建立；最后對光誘導過程中的光生物反應器進行了初步研究,成功優(yōu)化并放大了光誘導工藝。本文的研究為雨生紅球藻異養(yǎng)細胞光誘導高產(chǎn)蝦青素這一新模式的產(chǎn)業(yè)化提供了重要的理論基礎和實驗依據(jù)。
【學位授予單位】：華東理工大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：Q949.2;TQ28

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