本文關(guān)鍵詞：冰島硫化葉菌Sulfolobus islandicus新型ATPase的結(jié)構(gòu)與功能研究

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【摘要】：古菌是與細(xì)菌和真核生物并列的第三域生命形式,其細(xì)胞結(jié)構(gòu)和代謝方式與細(xì)菌類似但遺傳信息加工傳遞機(jī)制,包括DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、重組、修復(fù)和蛋白翻譯,更接近于真核生物。硫化葉菌是典型的超嗜熱泉古菌,生活于高溫及酸性極端環(huán)境,但其基因組保持穩(wěn)定,自發(fā)突變率并不高,暗示其細(xì)胞內(nèi)有一套完善的DNA修復(fù)系統(tǒng)。根據(jù)已有的報(bào)道,在硫化葉菌細(xì)胞中存在的DNA修復(fù)途徑包括同源重組修復(fù),核酸切除修復(fù)和堿基切除修復(fù)。與細(xì)菌相比,參與這些修復(fù)途徑的蛋白也更接近于真核生物。DNA雙鏈斷裂(double-strand breaks,DSBs)是細(xì)胞內(nèi)最嚴(yán)重的DNA損傷形式之一。同源重組修復(fù)和非同源末端鏈接是修復(fù)DSBs的兩種重要途徑。目前,在絕大多數(shù)古菌中只發(fā)現(xiàn)了同源重組修復(fù)途徑,對(duì)參與該途徑的保守蛋白Mrell,Rad50和重組酶RadA(真核生物中為Rad51)都有深入的研究。除此之外,對(duì)古菌中參與同源重組修復(fù)的其他蛋白也有較多的報(bào)道,包括NurA,HerA,Hjc和Hje等。Hollidayjunction(HJ)是同源重組過程中的標(biāo)志性中間產(chǎn)物,HJ需要被及時(shí)的處理以保證順利地完成DNA修復(fù)和染色體的正常分離。細(xì)胞內(nèi)處理HJ的方式主要有兩種,一種是由HJ解離酶介導(dǎo)的"resolution",典型的 HJ 解離酶包括 RuvC,Hjc,Yenl/GENl 和 Slxl-Slx4/SLX1-SLX4;另一種是由解旋酶、拓?fù)洚悩?gòu)酶及其他蛋白組成的復(fù)合體介導(dǎo)的"dissolution"。在細(xì)菌中已經(jīng)報(bào)道參與"resolution"過程的蛋白是RuvAB復(fù)合物。到目前為止,在古菌和真核生物中還沒有鑒定到經(jīng)典的類似于RuvAB的蛋白復(fù)合物。在本研究中,我們?cè)诔葻峁啪鶏u硫化葉菌S.islandicus細(xì)胞中表達(dá)了羧基端帶有組氨酸標(biāo)簽的解離酶Hjc(基因組中其編碼基因?yàn)镾iRe_1431),通過親和純化和質(zhì)譜鑒定發(fā)現(xiàn)了與Hjc在基因組上位置相鄰并可能與Hjc存在相互作用的一個(gè)蛋白,SiRe_1432。對(duì)氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn),SiRe_1432包含典型的PIN結(jié)構(gòu)域和P-loop ATPase結(jié)構(gòu)域,因此將SiRe_1432命名為SisPINA(冰島硫化葉菌來源的PINdomain-containingP-loopATPase)。進(jìn)一步,我們通過 Pull-down 實(shí)驗(yàn)確認(rèn)了 SisPINA 與 Hjc 具有物理相互作用,暗示著SisPINA與Hjc可能在細(xì)胞內(nèi)共同參與HJ的處理。為了探索SisPINA在冰島硫化葉菌S.islandicus中的功能,我們嘗試敲除細(xì)胞內(nèi)染色體上SisPINA的編碼基因,嘗試多次后始終無法獲得敲除SisPINA基因的缺失突變體菌株,暗示著SisPINA可能是一個(gè)不可敲除的基因。利用遺傳回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)我們確認(rèn)了SisPINA是S.islandicus細(xì)胞正常生長(zhǎng)所必須的基因。接下來,我們鑒定了 SisPINA的基本生化性質(zhì)。首先,構(gòu)建了表達(dá)野生型和四個(gè)不同點(diǎn)突變體的載體;然后,在E.coli也中進(jìn)行異源表達(dá)后并對(duì)目的蛋白進(jìn)行了純化。最后,我們鑒定了 SisPINA的ATP水解活性、DNA結(jié)合活性和HJ鏈遷移活性。ATP水解實(shí)驗(yàn)表明SisPINA具有明顯的ATP水解能力,不同的DNA底物對(duì)其ATPase活性無明顯的影響。凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)表明SisPINA能夠結(jié)合不同類型的DNA底物,包括單鏈DNA、鈍端雙鏈DNA、5'-overhangDNA、Y形DNA、復(fù)制叉DNA和HJ DNA,但是結(jié)合復(fù)制叉DNA和HJ DNA的能力明顯強(qiáng)于其他DNA底物。進(jìn)一步,我們發(fā)現(xiàn)SisPINA能催化HJ DNA發(fā)生鏈遷移,生成Y形的遷移產(chǎn)物,并能夠繼續(xù)解鏈Y形DNA產(chǎn)生單鏈DNA。同時(shí),我們確認(rèn)了 SisPINA的鏈遷移活性依賴其ATPase活性。為了進(jìn)一步研究SisPINA在細(xì)胞內(nèi)的生物學(xué)功能,我們鑒定了與SisPINA相互作用的蛋白并分析了蛋白之間的相互作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,SisPINA與Hjc具有功能上的相互作用,SisPINA能夠明顯增強(qiáng)Hjc切割不可動(dòng)HJDNA的解離酶活性,同時(shí),Hjc切割可動(dòng)HJ DNA的鏈的偏好性也受到SisPINA的調(diào)節(jié),但Hjc對(duì)SisPINA的HJ鏈遷移活性則有明顯的抑制作用。除了與Hjc有相互作用,SisPINA和RFCs及Hjm都能分別形成穩(wěn)定的復(fù)合物。Pull-down實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步確認(rèn)了 SisPINA的羧基端區(qū)域介導(dǎo)了SisPINA與Hjc,RFCs和Hjm的相互作用。最后,為了從原子水平上揭示SisPINA的作用機(jī)理,我們解析了 SisPINA兩個(gè)突變體的晶體結(jié)構(gòu)。SisPINAK261A的晶體結(jié)構(gòu)顯示,一個(gè)SisPINA的晶胞中包含有6個(gè)SisPINA蛋白分子,SisPINA可形成穩(wěn)定的環(huán)形六聚體,該結(jié)果與SisPINA在溶液中也形成六聚體的結(jié)果一致。進(jìn)一步分析組成SisPINA六聚體的亞基,我們發(fā)現(xiàn)六個(gè)亞基處于兩種不同的構(gòu)象,其中亞基A(B,C和E)為未結(jié)合ATP的構(gòu)象,亞基D(F)為結(jié)合ATP的構(gòu)象。通過ATP的結(jié)合和水解引起SisPINA構(gòu)象的變化,從而推動(dòng)HJ發(fā)生鏈遷移。SisPINAR147KI199SR206A的晶體結(jié)構(gòu)顯示,SisPINA的羧基端可折疊形成一個(gè)KH結(jié)構(gòu)域(hnRNP K homology結(jié)構(gòu)域),在SisPINAK261A的晶體結(jié)構(gòu)中由于電子密度缺失并未觀察到該區(qū)域的晶體結(jié)構(gòu)。有意思的是在該突變體的晶胞中只包含有一個(gè)SisPINAR147KI199SR206A蛋白分子,這種突變導(dǎo)致SisPINA發(fā)生解聚的分子機(jī)理還需要進(jìn)一步的研究。根據(jù)SisPINA和Hjc的晶體結(jié)構(gòu),以及SisPINA與Hjc功能上的相互作用,我們構(gòu)建了 SisPINA和Hjc共同處理HJDNA的結(jié)構(gòu)模型,該模型為揭示古菌中Holliday junction的處理機(jī)制提供了新的視角。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：Q936
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本文編號(hào)：1302756