本文關(guān)鍵詞：馬鈴薯油菜素內(nèi)酯合成限速酶基因StCPD和StDWF4對(duì)干旱和鹽脅迫的響應(yīng)

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【摘要】：油菜素內(nèi)酯(Brassinolide,BL)是第六大植物激素。目前,在各種作物中已共發(fā)現(xiàn)70多種油菜素內(nèi)酯化合物,總稱為油菜素內(nèi)酯類(lèi)化合物(Brassinosteroids,BRs)。CPD和DWF4基因分別編碼C-3氧化酶和C-22羥化酶,均被認(rèn)為是BRs合成的限速酶(Normura and Bishop,2006;Bancos et al.,2006)。近年來(lái)對(duì)BRs應(yīng)用報(bào)道很多,但對(duì)植物抵抗環(huán)境脅迫的能力,特別是通過(guò)轉(zhuǎn)基因手段提高植物抗逆性的研究報(bào)道較少。本文以馬鈴薯為材料,從中克隆到與擬南芥CPD和DWF4基因同源的全序列,分別構(gòu)建由花椰菜花葉病毒啟動(dòng)子(CaMV 35S)驅(qū)動(dòng)的植物過(guò)表達(dá)載體;采用MicroRNA(miRNA)技術(shù)構(gòu)建了pRS-CPD-Ri干擾表達(dá)載體,通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將這些載體分別導(dǎo)入“紫花白”馬鈴薯中,獲得轉(zhuǎn)基因系,對(duì)這些轉(zhuǎn)基因系的形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)和生理生化特征進(jìn)行分析與比較。主要結(jié)果如下:1.從馬鈴薯中分別克隆出與NCBI中的電子克隆序列(GenBank accession XM_006338792.1和XM_006340546.1)同源的全序列,分別命名為StCPD和StDWF4,序列大小分別為1473bp和1476bp,分別編碼490和491個(gè)氨基酸。St CPD與擬南芥CPD編碼的CYP90A1有77%的同源性,StDWF4與擬南芥DWF4編碼的CYP90B1有74%的同源性,分別命名為StCYP90A和StCYP90B。2.將StCPD和StDWF4分別插入植物表達(dá)載體pBI121,構(gòu)建CaMV 35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的過(guò)表達(dá)載體pBCPD和pBDWF4。通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法分別導(dǎo)入“紫花白”馬鈴薯,各得到11個(gè)和5個(gè)StDWF4基因轉(zhuǎn)基因系。qRT-PCR法分析以上各轉(zhuǎn)基因系的基因表達(dá)水平,所有轉(zhuǎn)基因系的基因表達(dá)量均高于對(duì)照(NT),C10除外。在過(guò)表達(dá)StCPD基因株系中,StDWF4基因與StCPD基因的轉(zhuǎn)錄水平呈負(fù)相關(guān)。而在過(guò)表達(dá)StDWF4基因株系中,StCPD基因與StDWF4基因的轉(zhuǎn)錄水平呈正相關(guān)�；虮磉_(dá)組織器官特異性分析顯示:StCPD在葉中表達(dá)量最高,莖次之,根中最低;StDWF4在根中表達(dá)量最高,莖次之,葉中最低。3.對(duì)轉(zhuǎn)StCPD基因和NT馬鈴薯試管苗進(jìn)行PEG模擬干旱脅迫處理,分析干旱處理與NT植株的生理生化指標(biāo)、抗氧化酶活性及表型差異,結(jié)果表明,StCPD基因過(guò)表達(dá)的馬鈴薯植株基因相對(duì)表達(dá)量顯著高于NT,隨脅迫時(shí)間延長(zhǎng),基因相對(duì)表達(dá)量逐漸增加,直到處理48h時(shí)略有下降。與NT相比,轉(zhuǎn)基因植株的丙二醛(MDA)含量降低;脯氨酸、可溶性蛋白、可溶性糖含量均提高;超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、過(guò)氧化物酶(POD)、谷胱甘肽還原酶(GR)和抗壞血酸過(guò)氧化物酶(APX))酶活性均顯著提高。隨脅迫時(shí)間的延長(zhǎng),轉(zhuǎn)StCPD基因和NT植株中,MDA含量逐漸增加,處理48h時(shí)略有下降;脯氨酸和可溶性糖含量持續(xù)增加;可溶性蛋白含量持續(xù)降低;SOD、POD、GR、CAT和APX酶活性均先增強(qiáng),48h時(shí)略有下降。干旱處理下,轉(zhuǎn)StCPD基因植株長(zhǎng)勢(shì)明顯優(yōu)于NT植株,株高、莖粗、根長(zhǎng)、鮮重等指標(biāo)都明顯高于NT植株。4.對(duì)轉(zhuǎn)StDWF4基因和NT馬鈴薯試管苗進(jìn)行NaCl模擬鹽脅迫處理,分析其生理生化指標(biāo)、抗氧化酶活性及表型差異,結(jié)果表明,轉(zhuǎn)St DWF4基因馬鈴薯植株較NT基因相對(duì)表達(dá)量顯著增高,隨脅迫時(shí)間延長(zhǎng)(0-24h),基因表達(dá)量逐漸增加。無(wú)論鹽脅迫還是對(duì)照處理,轉(zhuǎn)基因植株較NT的MDA含量顯著降低;對(duì)照和鹽脅迫條件下,轉(zhuǎn)StDWF4基因馬鈴薯脯氨酸含量是NT的1.25-1.55倍,可溶性蛋白含量為1.12-1.45倍,可溶性糖含量為1.41-2.89倍,SOD、POD、GR、CAT和APX酶活性分別為1.19-1.70倍,1.19-2.02倍,1.41-2.89倍,1.16-2.15倍,1.17-1.62倍。隨鹽脅迫時(shí)間延長(zhǎng),StDWF4基因過(guò)表達(dá)和NT植株中,MDA、脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白含量及SOD、POD、GR、CAT和APX酶活性均增強(qiáng)。鹽脅迫下,轉(zhuǎn)StDWF4基因植株長(zhǎng)勢(shì)明顯優(yōu)于NT植株,株高、莖粗、根長(zhǎng)、鮮重等指標(biāo)都明顯高于NT植株。5.利用人工microRNA技術(shù),以pRS300載體為基礎(chǔ),設(shè)計(jì)用于沉默馬鈴薯油菜素內(nèi)酯合成限速酶基因StCPD的amiRNA,并構(gòu)建表達(dá)載體p RS-CPD-Ri,將其導(dǎo)入“紫花白”馬鈴薯中進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化,獲得5個(gè)轉(zhuǎn)基因株系。CPD基因表達(dá)水平分析顯示,Ci1-Ci5轉(zhuǎn)基因系StCPD基因相對(duì)表達(dá)量分別為0.22,0.52,0.10,0.32和0.43,均較NT顯著降低。組織表達(dá)特異性分析表明,St CPD的表達(dá)量依次為葉莖根。轉(zhuǎn)基因植株的株高、莖粗、根長(zhǎng)和植株鮮重等指標(biāo)均較NT顯著下降。6.對(duì)基因表達(dá)量最低的p RS-CPD-Ri轉(zhuǎn)基因系Ci1,Ci3和Ci4試管苗,進(jìn)行PEG模擬干旱脅迫處理0 d,2 d,4 d和6 d,分析CPD基因表達(dá)情況、MDA和脯氨酸含量及表型變化。結(jié)果表明:轉(zhuǎn)p RS-CPD-Ri基因株系CPD基因相對(duì)表達(dá)量明顯低于NT,尤其是干旱處理6d時(shí),前者是后者的1.47倍;隨脅迫時(shí)間延長(zhǎng),基因表達(dá)量持續(xù)增強(qiáng)。干旱脅迫下,轉(zhuǎn)p RS-CPD-Ri基因馬鈴薯植株為NT MDA含量的1.07-1.17倍;而對(duì)照處理前者是后者的1.02-1.29倍;在對(duì)照和干旱條件下,StCPD基因干擾表達(dá)的馬鈴薯脯氨酸含量分別是NT的0.55-0.90倍,0.57-0.84倍。干旱處理15d后,轉(zhuǎn)基因植株株高、莖粗,根長(zhǎng),鮮重及薯的大小和鮮重等都明顯低于NT。以上結(jié)果表明:StCPD和StDWF4基因在馬鈴薯干旱和鹽脅迫的響應(yīng)過(guò)程中具有重要調(diào)控作用。
【學(xué)位授予單位】：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：Q943.2;S532

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本文編號(hào)：1300086