本文關(guān)鍵詞：丙肝病毒核心蛋白抑制單核細(xì)胞向巨噬細(xì)胞極化的作用研究

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【摘要】：背景和目的:丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)在絕大多數(shù)患者中呈現(xiàn)持續(xù)感染狀態(tài),最終可引起慢性肝炎、肝硬化,甚至在一些患者中發(fā)展為肝癌。HCV在體內(nèi)引起慢性感染并成功在體內(nèi)持續(xù)存在,部分原因是通過(guò)某些途徑逃避宿主免疫和干擾素誘導(dǎo)的抵御反應(yīng)。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)接近20%的急性HCV感染患者在不進(jìn)行治療的情況下自發(fā)清除病毒,這提示固有免疫和/或適應(yīng)性免疫應(yīng)答在控制HCV感染中發(fā)揮重要作用。單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞是對(duì)抗病原體入侵的第一道防線,依賴其強(qiáng)大的吞噬功能和抗原提呈功能發(fā)揮重要的免疫監(jiān)視和免疫調(diào)節(jié)作用。然而,它們?cè)诼员透窝赘腥局械淖饔萌匀徊皇鞘智宄�。我們�(cè)谇捌诠ぷ髦邪l(fā)現(xiàn)丙型肝炎病毒核心蛋白(HCV core protein)抑制單核細(xì)胞分化為樹(shù)突狀細(xì)胞(Dendritic cells,DCs)。本實(shí)驗(yàn)中,我們主要研究HCV core蛋白是否影響外周血單核細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞。這可能是HCV持續(xù)感染的重要原因。研究方法:利用梯度離心法分離健康人外周血單個(gè)核細(xì)胞(Peripheral blood mononuclear,PBMCs),利用免疫磁珠分選方法純化CD14+單核細(xì)胞。培養(yǎng)純化后的CD14+單核細(xì)胞,加入粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor,GM-CSF)誘導(dǎo)5天,換液后加入干擾素-γ(interferon-γ,IFN-γ)和脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)繼續(xù)誘導(dǎo)24小時(shí),使單核細(xì)胞向M1型巨噬細(xì)胞極化;加入巨噬細(xì)胞集落刺激因子(macrophage colony stimulating factor,M-CSF)誘導(dǎo)5天,換液后加入白細(xì)胞介素-4(interleukin-4,IL-4)和IL-13繼續(xù)誘導(dǎo)24小時(shí),使單核細(xì)胞向M2型巨噬細(xì)胞極化。利用流式細(xì)胞術(shù)、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA)和實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real-time quantitative polymerase chain,RT-q PCR),分別在表型、細(xì)胞因子和基因水平驗(yàn)證巨噬細(xì)胞的誘導(dǎo)是否成功。從健康者和直接抗病毒藥(direct-acting antivirals,DAAs)治療前后的慢性丙型肝炎病毒(Chronic Hepatitis C virus,CHC)感染患者的外周血中分離出單個(gè)核細(xì)胞。利用免疫磁珠純化CD14+單核細(xì)胞,利用上述相應(yīng)的刺激劑和刺激條件誘導(dǎo)單核細(xì)胞極化為M1和M2兩種亞型的巨噬細(xì)胞。在表型、細(xì)胞因子分泌和基因表達(dá)層面分析HCV對(duì)巨噬細(xì)胞極化的影響。在體外實(shí)驗(yàn)中,純化健康者外周血CD14+單核細(xì)胞,在M1和M2型巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)體系中加入HCV core蛋白或β-半乳糖苷酶,利用流式細(xì)胞術(shù)、ELISA和RT-q PCR,分別在表型、細(xì)胞因子和基因水平測(cè)定HCV core蛋白對(duì)巨噬細(xì)胞極化的影響。另外,行吞噬實(shí)驗(yàn)和T細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn),利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)加或不加HCV core蛋白誘導(dǎo)而成的巨噬細(xì)胞的吞噬功能、抗原提呈功能及對(duì)CD4+T細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)功能。利用western blot測(cè)定HCV core蛋白對(duì)巨噬細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活子(Signal Transducer And Activator Of Transcription,STAT)表達(dá)的影響。為了研究HCV core蛋白抑制單核細(xì)胞向巨噬細(xì)胞分化的分子機(jī)制,toll樣受體(toll-like receptor,TLR)2的配體(Pam3CSK4)、TLR2的抗體和STATs的抑制劑加入巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)體系中進(jìn)行研究。如上,利用流式細(xì)胞術(shù)、ELISA和RT-q PCR檢測(cè)信號(hào)分子TLR2和STATs對(duì)巨噬細(xì)胞極化的影響。研究結(jié)果:(1)分離純化健康人外周血CD14+單核細(xì)胞,加入GM-CSF、IFN-γ和LPS可成功誘導(dǎo)M1型巨噬細(xì)胞;加入M-CSF、IL-4和IL-13可成功誘導(dǎo)M2型巨噬細(xì)胞。M1型巨噬細(xì)胞高表達(dá)表型CD80、CD86,分泌較高水平的促炎性細(xì)胞因子TNF-α,高表達(dá)基因誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(Inducible NitricOxide Synthase,i NOS);而M2型巨噬細(xì)胞高表達(dá)CD163、CD206,分泌較高抗炎性細(xì)胞因子IL-10,高表達(dá)基因精氨酸酶1(arginase 1,Arg1)。(2)與健康對(duì)照者相比,慢性丙型肝炎患者來(lái)源的單核細(xì)胞,分化為M1和M2型巨噬細(xì)胞的能力均是受損的。而DAAs治療對(duì)HCV病毒部分清除后,HCV患者巨噬細(xì)胞的極化能力得到部分恢復(fù),進(jìn)一步驗(yàn)證了HCV病毒抑制單核細(xì)胞向巨噬細(xì)胞極化。(3)體外實(shí)驗(yàn)證實(shí),HCV core蛋白抑制單核細(xì)胞向M1和M2型巨噬細(xì)胞極化,并抑制極化的M1和M2型巨噬細(xì)胞的吞噬功能。而且HCV core蛋白參與誘導(dǎo)的M1型巨噬細(xì)胞抑制自體和同種異體的CD4+T細(xì)胞增殖,而該蛋白參與誘導(dǎo)的M2型巨噬細(xì)胞促進(jìn)自體和同種異體的CD4+T細(xì)胞增殖。(4)Pam3CSK4和HCV core蛋白作用類(lèi)似,在表型、細(xì)胞因子和基因水平抑制單核細(xì)胞分化為M1和M2型巨噬細(xì)胞。而TLR2的抗體可以逆轉(zhuǎn)HCVcore蛋白的抑制作用。HCV core蛋白抑制M1型巨噬細(xì)胞STAT1的磷酸化和M2型巨噬細(xì)胞STAT3的磷酸化水平。STAT1的抑制劑(fludarabine)和STAT3的抑制劑(stattic)在基因水平而非表型和細(xì)胞因子水平分別抑制M1和M2型巨噬細(xì)胞的極化。結(jié)論:(1)利用GM-CSF、IFN-γ、LPS可成功誘導(dǎo)外周血單核細(xì)胞極化成為M1型巨噬細(xì)胞,而利用M-CSF、IL-4、IL-13可成功誘導(dǎo)單核細(xì)胞成為M2型巨噬細(xì)胞。(2)HCV抑制單核細(xì)胞向M1和M2型巨噬細(xì)胞極化。(3)HCV core蛋白抑制單核細(xì)胞向巨噬細(xì)胞分化。而且,HCV core蛋白使M1和M2型巨噬細(xì)胞吞噬功能下降;使M1和M2型巨噬細(xì)胞的抗原提呈功能及對(duì)T細(xì)胞的調(diào)節(jié)功能紊亂。(4)在慢性HCV感染中,HCV core蛋白通過(guò)TLR2/STATs信號(hào)抑制單核細(xì)胞極化為巨噬細(xì)胞。因巨噬細(xì)胞分化障礙而引起的免疫功能紊亂可能是HCV持續(xù)感染和難以清除的重要原因。本文的創(chuàng)新點(diǎn)是通過(guò)對(duì)HCV抑制巨噬細(xì)胞分化的作用及機(jī)制研究,提出阻斷HCV core蛋白與TLR2的結(jié)合可能是治療HCV感染的一種新方案。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R373

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前6條

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本文編號(hào)：1295100