本文關(guān)鍵詞：微生物蛋白�；揎椗c合成代謝調(diào)控

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【摘要】：蛋白賴氨酸酰基化修飾是一種動態(tài)可逆的翻譯后修飾,通過調(diào)控蛋白的活性,定位,以及蛋白間的相互作用來影響諸多生物過程。蛋白�；揎棙�(gòu)建了�；�-CoA代謝與胞內(nèi)信號通路網(wǎng)絡(luò)的關(guān)聯(lián)性。�；揎椝脚c細(xì)胞內(nèi)�；�-CoA的濃度與種類密切相關(guān),高濃度酰基-CoA的積累能通過酶催化與非酶催化的方式影響�；揎椀某潭�,從而影響細(xì)胞內(nèi)多樣的生理功能。此外,酰基-CoA可以作為合成代謝產(chǎn)物的前體,用于不同類型產(chǎn)物的生物合成中。本文以多種微生物模型為研究對象,系統(tǒng)研究了蛋白�；揎椀陌l(fā)生及動態(tài)變化對合成代謝途徑中關(guān)鍵酶的反饋調(diào)控作用,同時也從代謝物影響�；揎椀慕嵌�,鑒定了一種受到氨基酸變構(gòu)調(diào)控的蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)。研究由以下四部分組成:(1)紅霉糖多孢菌(Saccharopolyspora erythraea)蛋白丙二�；ㄐ约岸垦芯�:我們結(jié)合了高靈敏度的質(zhì)譜技術(shù)以及高親和性的賴氨酸丙二�；贵w富集技術(shù),對紅霉糖多孢菌中蛋白賴氨酸丙二�；揎椀孜镞M(jìn)行了鑒定。這是首次在原核生物中進(jìn)行蛋白丙二�；揎椊M學(xué)的報道。此外,我們結(jié)合生物信息學(xué)工具,進(jìn)行了修飾底物的功能定位,位點分析,相互作用分析等。并通過點突變分析模擬了賴氨酸丙二�；稽c對代謝酶的調(diào)控作用。此后,我們針對對數(shù)生長期及平臺期S.erythraea菌的蛋白丙二�；揎椷M(jìn)行定量分析,揭示了不同生長周期蛋白丙二�；揎椀膭討B(tài)變化。在此基礎(chǔ)上,我們發(fā)現(xiàn)丙二酸鹽添加情況下,紅霉糖多孢菌和天藍(lán)色鏈霉菌(Streptomyces coelicolor)體內(nèi)賴氨酸丙二�；揎椝降牟町�。證明了細(xì)胞內(nèi)丙二酰-CoA的濃度影響了蛋白丙二�；男揎椝�,從而為蛋白�；揎椗c微生物合成代謝途徑關(guān)聯(lián)性的研究打下了基礎(chǔ)。(2)蛋白�；答佌{(diào)控機制對紅霉素合成的影響:通過定量蛋白�；M學(xué)分析,我們發(fā)現(xiàn)S.erytraea菌的野生WT型相對于高產(chǎn)E3菌而言,在蛋白乙�；揎椪w水平?jīng)]有差異的情況下,丙�；揎椪w水平顯著提高。我們進(jìn)一步通過酶活分析,探究了蛋白丙�；揎棇Ρ�-CoA合成通路中丙二酸半醛脫氫酶(mmsA2)的抑制作用,揭示了在產(chǎn)物合成過程中,存在�；揎棇铣赏緩酱x酶的反饋調(diào)控。此后,我們在工業(yè)生產(chǎn)紅霉素的過程中,通過對不同濃度正丙醇添加后的紅霉素產(chǎn)量測定及丙�；孜锏姆治�,證明了蛋白丙�；揎椖軌蛲ㄟ^抑制丙醛脫氫酶以及SAM合成酶的活性,降低了紅霉素的產(chǎn)量。最后,我們在S.erythraea高產(chǎn)菌中過表達(dá)去�；�,緩解了高正丙醇添加情況下的蛋白丙�；种谱饔�。我們的研究首次建立了蛋白�；揎椗c微生物產(chǎn)物合成途徑的關(guān)聯(lián)性,擴展了對蛋白酰化修飾調(diào)控廣泛性的認(rèn)知。(3)蛋白酰基化調(diào)控機制存在于多種以�；�-CoA為前體的產(chǎn)物合成中:我們首先證明了蛋白酰化修飾反饋抑制效應(yīng)存在于以丙二酰-CoA為前體的十一烷基靈菌紅素的生物合成中,接著又證明了蛋白�；揎椨绊懥四茉搭愇镔|(zhì)丁醇的生物合成。在此基礎(chǔ)上,我們進(jìn)一步探討蛋白酰化反饋調(diào)控效應(yīng)對以底盤大腸桿菌(Eschericia coli)細(xì)胞為合成工廠的人工構(gòu)建型的丙二酰-CoA依賴性赤松素合成途徑的影響。證明了蛋白丙二�；揎椖軌蛞种�4-對香豆酸連接酶(4CL)以及芪合成酶(STS)的活性,從而抑制赤松素的產(chǎn)量。最后,我們通過對丙二�；揎椀馁嚢彼嵛稽c改造為精氨酸的方式,避免了�；揎椀陌l(fā)生,一定程度上解除了賴氨酸丙二�；囊种谱饔�,提高了赤松素的產(chǎn)量。該研究證明�；�-CoA前體量的增加能夠提高產(chǎn)物產(chǎn)量的同時,也增加了賴氨酸�；揎椀乃�,并對產(chǎn)物合成途徑產(chǎn)生抑制作用。這是細(xì)胞針對內(nèi)源性及外源性產(chǎn)物合成途徑做出的反饋調(diào)控機制,涉及到不同類型產(chǎn)物的生物合成中。(4)基于代謝物變構(gòu)調(diào)控的乙酰轉(zhuǎn)移酶功能研究:在研究蛋白�；揎椨绊懘x途徑的基礎(chǔ)上,我們同時探究代謝物對酰化修飾系統(tǒng)的調(diào)控作用。我們發(fā)現(xiàn)桔橙小單孢菌(Micromonosporaaurantiaca)菌中包含一種同時含有ACT結(jié)構(gòu)域和GNAT結(jié)構(gòu)域的蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶MaKat。通過FRET實驗,我們證明Cys和Arg可能與ACT結(jié)構(gòu)域相互作用并引起構(gòu)象的變化。此后,我們進(jìn)一步證明Cys和Arg可以提高M(jìn)aKat的活性,并提升底物乙酰-CoA合成酶MaAcs的乙�；�,即證明MaKat是一種氨基酸調(diào)控型乙酰轉(zhuǎn)移酶。這種新型乙酰轉(zhuǎn)移酶的發(fā)現(xiàn),表明放線菌中蛋白的乙酰化水平以及乙酰轉(zhuǎn)移酶的活性可能與細(xì)胞內(nèi)氨基酸的濃度密切相關(guān)。該研究不僅豐富了我們對原核生物蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶家族的認(rèn)知,同時也為代謝產(chǎn)物作用于�；揎椣到y(tǒng)的研究打下了基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：華東理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：Q78
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本文編號：1293770