本文關鍵詞：DNA復制起始過程中MCM復合物構象變化的機制研究

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【摘要】：對于所有物種來說,DNA復制都是最基本最具決定性的生物過程之一。生物性狀的繼承和物種的繁衍都依賴于儲存在DNA上的遺傳信息的精確拷貝。為了確保遺傳信息的準確傳遞,DNA復制過程需要受到嚴格的時空控制,尤其在復制起始階段。該階段的控制主要通過復制解旋酶的裝載和激活得以實現(xiàn)。真核生物細胞在G1期時,復制解旋酶核心MCM以無活性的雙六聚體構象裝載于復制起點的雙鏈DNA上。在S期時MCM被激活,從而啟動DNA雙向復制,但具體激活機制仍然未知。本研究針對真核DNA復制這一關鍵科學問題,采用了不同于此前體外重建的新策略,以MCM的構象變化為切入點,對復制解旋酶激活的分子機制進行了較為深入的探索。本研究首先探究了釀酒酵母體內Mcm2-7雙六聚體的構象變化及其機制。通過建立直接檢測和純化內源雙六聚體Mcm2-7的方法,首次觀察到內源雙六聚體Mcm2-7于G1期裝配到染色質上,并且在s期發(fā)生分離的現(xiàn)象。同時檢測到Mcm10蛋白能夠與染色質組分中的雙六聚體Mcm2-7被共同純化。這種Mcm10與非活性構象解旋酶之間特異的相互作用暗示著Mcm10有可能參與了解旋酶的分離激活過程。為此,通過建立的體內雙六聚體Mcm2-7分離分析技術,本研究結果證明雙六聚體Mcm2-7的分離是s期復制解旋酶激活、啟動復制過程中的一個新的必需步驟,并且當Mcm10蛋白被誘導降解后,Mcm2-7雙六聚體無法分離。為了進一步揭示Mcm10作用機制,本研究詳細分析了Mcm10與Mcm2-7相互作用的結構域,證明Mcm 10的C端能直接與Mcm2-7結合并且是介導該相互作用的主要結構域。C端敲除突變體(mcmlOAC)表現(xiàn)出顯著的復制以及生長缺陷,而通過GFP-GBP融合技術重建Mcm10突變體與Mcm2-7的相互作用則可以回補上述缺陷。這些結果證實mcm10△C在復制中的缺陷是由Mcm10-MCM相互作用被破壞而造成的。更重要的是,mcm10AC突變體中雙六聚體Mcm2-7在s期的分離明顯延遲,從而將Mcm10的一個必需功能更精確地定位到雙六聚體解離這一變構步驟。基于以上結果,本研究提出了一個Mcm10-MCM動態(tài)相互作用介導的真核復制解旋酶Mcm2-7雙六聚體分離變構激活模型。此外,本研究還以極端嗜熱古菌冰島硫化葉菌MCM (sisMCM)為模式,對這類保守的真核生物簡化版的關鍵復制解旋酶進行了生化分析。本實驗室前期報道了古菌甲基轉移酶aKMT4。有意思的是,重組sisMCM到體外也能被aKMT4甲基化。通過質譜分析,鑒定到三簇賴氨酸殘基位點的單甲基化修飾,并且這些位點的甲基化修飾也存在于內源sisMCM中。在體外DNA解旋酶反應溫度(65℃)下,甲基化修飾使sisMCM解旋酶活性增強了約50%。當對sisMCM先進行了高溫(80℃C,硫化葉菌最適生長溫度)預處理,甲基化修飾后sisMCM的解旋酶活性增強了約100%。此外,sisMCM解旋酶在80℃C的半衰期從2.8小時延長至7.2小時。sisMCM的模擬甲基化突變體表現(xiàn)出與甲基化修飾sisMCM一致的熱穩(wěn)定解旋酶活性。三簇被甲基化修飾的賴氨酸殘基位點均位于sisMCM六聚體表面,由此推測甲基化修飾可能通過改變疏水性和表面電荷來調節(jié)sisMCM分子內和分子間的相互作用。上述結果說明古菌可能通過甲基化修飾來提高自身蛋白的動力學穩(wěn)定性,從而增強它們對極端高溫環(huán)境的適應性。DNA復制解旋酶MCM活性的調節(jié)和控制機制是目前DNA復制研究領域的重點核心課題。本研究的結果為解決這一幾十年來懸而未決的經典難題提供了重要線索,將有助于推動真核DNA復制起始過程的完整模型的解析,從而增進人們對細胞生長增殖規(guī)律的認識。
【學位授予單位】：中國農業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：Q523

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本文編號：1293620