發(fā)布時(shí)間：2017-12-15 22:15

  本文關(guān)鍵詞：DNA復(fù)制起始過(guò)程中MCM復(fù)合物構(gòu)象變化的機(jī)制研究

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【摘要】：對(duì)于所有物種來(lái)說(shuō),DNA復(fù)制都是最基本最具決定性的生物過(guò)程之一。生物性狀的繼承和物種的繁衍都依賴于儲(chǔ)存在DNA上的遺傳信息的精確拷貝。為了確保遺傳信息的準(zhǔn)確傳遞,DNA復(fù)制過(guò)程需要受到嚴(yán)格的時(shí)空控制,尤其在復(fù)制起始階段。該階段的控制主要通過(guò)復(fù)制解旋酶的裝載和激活得以實(shí)現(xiàn)。真核生物細(xì)胞在G1期時(shí),復(fù)制解旋酶核心MCM以無(wú)活性的雙六聚體構(gòu)象裝載于復(fù)制起點(diǎn)的雙鏈DNA上。在S期時(shí)MCM被激活,從而啟動(dòng)DNA雙向復(fù)制,但具體激活機(jī)制仍然未知。本研究針對(duì)真核DNA復(fù)制這一關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題,采用了不同于此前體外重建的新策略,以MCM的構(gòu)象變化為切入點(diǎn),對(duì)復(fù)制解旋酶激活的分子機(jī)制進(jìn)行了較為深入的探索。本研究首先探究了釀酒酵母體內(nèi)Mcm2-7雙六聚體的構(gòu)象變化及其機(jī)制。通過(guò)建立直接檢測(cè)和純化內(nèi)源雙六聚體Mcm2-7的方法,首次觀察到內(nèi)源雙六聚體Mcm2-7于G1期裝配到染色質(zhì)上,并且在s期發(fā)生分離的現(xiàn)象。同時(shí)檢測(cè)到Mcm10蛋白能夠與染色質(zhì)組分中的雙六聚體Mcm2-7被共同純化。這種Mcm10與非活性構(gòu)象解旋酶之間特異的相互作用暗示著Mcm10有可能參與了解旋酶的分離激活過(guò)程。為此,通過(guò)建立的體內(nèi)雙六聚體Mcm2-7分離分析技術(shù),本研究結(jié)果證明雙六聚體Mcm2-7的分離是s期復(fù)制解旋酶激活、啟動(dòng)復(fù)制過(guò)程中的一個(gè)新的必需步驟,并且當(dāng)Mcm10蛋白被誘導(dǎo)降解后,Mcm2-7雙六聚體無(wú)法分離。為了進(jìn)一步揭示Mcm10作用機(jī)制,本研究詳細(xì)分析了Mcm10與Mcm2-7相互作用的結(jié)構(gòu)域,證明Mcm 10的C端能直接與Mcm2-7結(jié)合并且是介導(dǎo)該相互作用的主要結(jié)構(gòu)域。C端敲除突變體(mcmlOAC)表現(xiàn)出顯著的復(fù)制以及生長(zhǎng)缺陷,而通過(guò)GFP-GBP融合技術(shù)重建Mcm10突變體與Mcm2-7的相互作用則可以回補(bǔ)上述缺陷。這些結(jié)果證實(shí)mcm10△C在復(fù)制中的缺陷是由Mcm10-MCM相互作用被破壞而造成的。更重要的是,mcm10AC突變體中雙六聚體Mcm2-7在s期的分離明顯延遲,從而將Mcm10的一個(gè)必需功能更精確地定位到雙六聚體解離這一變構(gòu)步驟�；谝陨辖Y(jié)果,本研究提出了一個(gè)Mcm10-MCM動(dòng)態(tài)相互作用介導(dǎo)的真核復(fù)制解旋酶Mcm2-7雙六聚體分離變構(gòu)激活模型。此外,本研究還以極端嗜熱古菌冰島硫化葉菌MCM (sisMCM)為模式,對(duì)這類保守的真核生物簡(jiǎn)化版的關(guān)鍵復(fù)制解旋酶進(jìn)行了生化分析。本實(shí)驗(yàn)室前期報(bào)道了古菌甲基轉(zhuǎn)移酶aKMT4。有意思的是,重組sisMCM到體外也能被aKMT4甲基化。通過(guò)質(zhì)譜分析,鑒定到三簇賴氨酸殘基位點(diǎn)的單甲基化修飾,并且這些位點(diǎn)的甲基化修飾也存在于內(nèi)源sisMCM中。在體外DNA解旋酶反應(yīng)溫度(65℃)下,甲基化修飾使sisMCM解旋酶活性增強(qiáng)了約50%。當(dāng)對(duì)sisMCM先進(jìn)行了高溫(80℃C,硫化葉菌最適生長(zhǎng)溫度)預(yù)處理,甲基化修飾后sisMCM的解旋酶活性增強(qiáng)了約100%。此外,sisMCM解旋酶在80℃C的半衰期從2.8小時(shí)延長(zhǎng)至7.2小時(shí)。sisMCM的模擬甲基化突變體表現(xiàn)出與甲基化修飾sisMCM一致的熱穩(wěn)定解旋酶活性。三簇被甲基化修飾的賴氨酸殘基位點(diǎn)均位于sisMCM六聚體表面,由此推測(cè)甲基化修飾可能通過(guò)改變疏水性和表面電荷來(lái)調(diào)節(jié)sisMCM分子內(nèi)和分子間的相互作用。上述結(jié)果說(shuō)明古菌可能通過(guò)甲基化修飾來(lái)提高自身蛋白的動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定性,從而增強(qiáng)它們對(duì)極端高溫環(huán)境的適應(yīng)性。DNA復(fù)制解旋酶MCM活性的調(diào)節(jié)和控制機(jī)制是目前DNA復(fù)制研究領(lǐng)域的重點(diǎn)核心課題。本研究的結(jié)果為解決這一幾十年來(lái)懸而未決的經(jīng)典難題提供了重要線索,將有助于推動(dòng)真核DNA復(fù)制起始過(guò)程的完整模型的解析,從而增進(jìn)人們對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖規(guī)律的認(rèn)識(shí)。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：Q523

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本文編號(hào)：1293620